《Journal of Neurochemistry》：Writing the Engram: Epigenetic Mechanisms of Memory Allocation
记忆分配是指在学习事件中，特定神经元被选择性招募到编码、存储和检索该经验的功能集群（即印迹细胞）的过程。传统上，这一过程被认为主要由神经元内在兴奋性（IE）驱动。然而，近年研究表明，转录和表观遗传异质性在偏倚神经元纳入印迹方面扮演着关键角色。本文综述了影响此过程的机制，包括CREB介导的兴奋性、转录启动和表观遗传调控，并强调了电生理特性与表观遗传景观如何汇聚共同塑造记忆分配这一研究尚浅的关联。
1 引言
记忆可定义为经验依赖性的行为改变，其持续存在超过引发它的环境刺激。生理上，记忆存储于大脑细胞的一个子集中，即印迹细胞。印迹集群经历一个多阶段过程，包括记忆分配、编码、巩固和提取。虽然记忆编码、巩固和提取的分子细胞机制已被广泛研究，但记忆分配——即选择特定神经元编码给定记忆形成印迹集群的分子基础——直到最近才开始受到重视。
早期研究集中在内在兴奋性（IE）、转录因子CREB（cAMP反应元件结合蛋白）和即刻早期基因（IEGs）的表达水平作为印迹痕迹招募的核心决定因素。但上游因素仍不清楚。新证据表明，表观遗传异质性（指不涉及DNA序列改变的染色质状态差异）是偏倚神经元招募到记忆痕迹的内在因素。
1.1 CREB、兴奋性与神经元竞争
记忆分配的首个分子线索源于观察到，通过立体定位注射疱疹 simplex 病毒（HSV）在侧杏仁核（LA）神经元亚群中上调CREB，会偏倚这些神经元被招募到印迹集群。CREB过表达增强记忆形成，增加恐惧训练后的长时程记忆表达。后续研究表明，具有较高IE的神经元（可能是CREB水平升高的结果）表现出比邻近神经元更强的突触强度，增加了它们被纳入记忆集群的概率。这产生了印迹分配竞争性的概念，即兴奋性更高的神经元“赢得”编码记忆的竞争。一旦被偏倚分配，这些神经元成为印迹的功能必需组件。然而，为何某些神经元在接受相似输入时表现出更高CREB表达或兴奋性，仍知之甚少。内源性IE波动决定了哪些神经元被选择编码记忆，但CREB变化的时程可能与兴奋性可塑性不同，且CREB非依赖的细胞内通路如何调控兴奋性及相关基因程序也有待研究。
2 印迹分配的表观遗传调控
2.1 表观遗传可塑性：记忆招募的预学习启动代码
虽然突触活动引发受表观遗传机制调控的转录级联是公认的，但此概念传统上与记忆形成、巩固和提取相关。有趣的是，许多CREB靶基因调控染色质重塑和组蛋白乙酰化，提示CREB在预学习神经元“资格”中的作用本身受神经元表观遗传状态调控。新发现支持这一观点，表明表观遗传细胞间变异性影响神经元功能，这些变异似乎在神经元亚群中建立了一种启动状态，使其易于并入印迹集群。
2.2 组蛋白乙酰化与染色质可及性
Santoni等人（2024）首次提供了组蛋白乙酰化水平与IE及印迹分配直接关联的证据。LA主要神经元在染色质压缩方面表现出天然异质性。类似地，H3K27ac在LA中也存在异质性，但在记忆形成后表达IEG cFos的神经元中特异性升高。相应地，过表达组蛋白乙酰转移酶（HATs），如CREB结合蛋白（CBP）或赖氨酸乙酰转移酶5（KAT5），增加了H3K27ac并诱导这些神经元优先招募到印迹中。相反，其下调阻止神经元被招募，表明组蛋白乙酰化方面的染色质可塑性在偏倚分配中的必要性和充分性。
后续染色质可及性和基因表达并发分析显示，组蛋白超乙酰化增加了染色质开放性，并上调了与神经元兴奋性、结构重塑和突触可塑性相关的基因。这些表观遗传启动的神经元在形态上表现为树突棘密度增加，并离体膜片钳记录显示IE增高。行为上，注射CBP和KAT5的小鼠在场景恐惧条件反射（CFC）后长达8天表现出更强的记忆。光遗传学沉默HAT过表达神经元消除了记忆提取，证明了染色质状态与记忆表达间的因果关系。
2.3 DNA甲基化
Odell等人（2020）描述了另一种表观遗传模式：DNA甲基化。研究聚焦于DNA甲基转移酶3A（DNMT3A），该酶催化甲基基团添加到胞嘧啶碱基，对于发育中出现中间甲基化区域（IMRs）至关重要，这些区域定义了调控神经元特异性兴奋性和招募的双稳态表观等位基因。在海马齿状回（DG），条件性敲除DNMT3A导致CpG位点IMRs低甲基化，神经元活动降低。反之，DNMT3A过表达增加了IMRs的甲基化，提高了神经元兴奋性，并增强了被招募到编码集群的概率，而不改变整体印迹大小。比较新环境暴露1小时后被招募（FOS阳性）与未招募（FOS阴性）的神经元，单核简化代表性亚硫酸氢盐测序（snRRBS）显示被招募的DG神经元在IMRs甲基化增加。靶向甲基化编辑特定表观等位基因直接影响神经元兴奋性及最终在印迹网络中的招募。
2.4 组蛋白甲基化
虽然组蛋白超乙酰化和DNA超甲基化作为允许性表观遗传启动事件，抑制性表观遗传标记也可负向偏倚记忆分配。最近在恐惧记忆形成期间的CRISPR-Cas9敲除筛选中发现，组蛋白赖氨酸特异性去甲基酶4a（KDM4A）作为记忆分配的关键负调控因子。此酶去甲基化组蛋白3 lysine 9和36的三甲基残基——分别与基因抑制和激活相关。敲低KDM4A仅导致H3K36me3增加，以及神经元激活和招募到印迹的可能性增加，同样不扩大整体印迹大小。批量RNA测序显示钙内流和学习相关基因Trpm7上调，这是由于降低KDM4A增加了H3K36me3水平，允许活动依赖性爆发转录，从而为记忆编码准备突触蛋白。功能上，KDM4A缺失诱导苔状纤维膨大增大，从而将染色质重塑、突触前可塑性和环路成熟的变化与记忆分配联系起来。
2.5 表观遗传驱动记忆分配的新兴模型
这些研究汇聚于一个共享机制：学习前，表观遗传异质性作为记忆分配的分子代码，通过组蛋白超乙酰化和增加染色质可及性、双稳态位点转录允许性DNA甲基化模式，或通过组蛋白低甲基化介导的减少表观遗传抑制来制动印迹纳入。更转录允许的染色质状态因此启动神经元兴奋性和转录准备就绪，随后由神经元活动诱导的染色质开放和关键基因（IEGs、突触基因）乙酰化主动巩固，最终导致巩固分配到长时程记忆痕迹所需的结构和突触重塑。
3 病理中的分配
尽管记忆分配在正常认知功能中的重要性已确立，但病理条件下错误分配的可能性及其是否由表观遗传介导仍待探索。多种神经疾病在记忆分配相关基因（如CREB、CBP/p300和DNA甲基化酶）中存在突变，提示这些障碍相关的记忆损伤可能至少部分源于异常记忆分配机制。
3.1 CREB改变——以精神分裂症为例
精神分裂症影响全球约2400万人，其多巴胺信号传导异常，CREB被提出作为精神分裂症中多巴胺能信号的汇聚蛋白。考虑到分配相关的CREB与BDNF之间的联系，精神分裂症中观察到的记忆损伤与记忆分配方式改变之间存在关联是合理的。
3.2 乙酰化相关病理
3.2.1 Rubinstein-Taybi综合征（RTS）：CBP和p300突变
RTS是一种罕见神经发育疾病，由CBP或p300基因变异引起，特征为智力残疾。模拟RTS的CBP+/-小鼠显示记忆缺陷和H2B乙酰化水平降低，其晚期长时程增强（l-LTP）缺陷，而组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂SAHA可恢复其组蛋白乙酰化缺陷、l-LTP和记忆能力，提示记忆分配紊乱可能是RTS中组蛋白低乙酰化与记忆形成受损之间的功能联系。
3.2.2 Arboleda-Tham综合征（ARTHS）：KAT6A突变
ARTHS由KAT6A新生杂合无义突变引起，特征为智力残疾。KAT6A突变小鼠显示识别和空间记忆缺陷，海马CA3区树突棘密度显著降低和Wnt信号蛋白水平减少。Wnt信号缺陷与神经元IE降低和树突棘形态发生调控相关，因此ARTHS可能代表记忆分配功能障碍的疾病。
3.3 DNA甲基化相关病理
3.3.1 Rett综合征（RTT）：MeCP2突变
RTT由甲基CpG结合蛋白2（MeCP2）突变引起，是女性智力低下的第二大原因。RTT小鼠显示空间和恐惧学习缺陷，CA1区突触改变。MeCP2突变后无法与效应子（包括CREB）相互作用，可能导致IE失衡。研究发现RTT小鼠CA1区兴奋/抑制（E/I）比率失衡，分配印迹大小大于野生型，CFC表现更差。
3.3.2 Tatton-Brown-Rahman综合征（TBRS）：DNMT3A突变
TBRS由DNMT3A新生突变引起，特征包括智力残疾。Odell等人（2020）表明增加DNA甲基化和双稳态区域甲基化表观等位基因比例增强内在兴奋性，从而增加神经元被分配到新记忆的机会。TBRS中DNMT3A突变影响酶正常功能，记忆缺陷可能由与记忆分配相关的神经元IE改变引起。
3.4 组蛋白甲基化相关病理
3.4.1 注意缺陷多动障碍（ADHD）：KDM4A突变
ADHD全球患病率高，Kdm4a被识别为ADHD风险基因。KDM4A海马敲低导致神经元活动和印迹集群分配增加。ADHD患者通常表现为皮质内抑制降低，工作记忆相关ERP峰显示神经元放电减少，提示记忆分配缺陷可能促成ADHD。
3.4.2 智力低下X连锁Claes-Jensen型综合征（MRXSCJ）：KDM5C突变
MRXSCJ由KDM5C无义和错义突变引起。KDM5C KO小鼠在听觉恐惧条件反射（aFC）和CFC中冻结减少，MWM中到达隐藏平台延迟增加，显示树突arborization和脊柱形态缺陷。KDM5C敲低增强了活动调节基因（如Arc、cFos、Npas4）的基础表达水平，反而削弱了这些靶基因的诱导性，可能导致记忆编码时细胞错误分配到新集群。
3.5 阿尔茨海默病（AD）
AD与记忆丧失相关，但研究开始探索记忆并非真正丢失，而是在自然条件下变得无法访问（沉默印迹）。在5xFAD AD小鼠模型中，条件性删除细胞死亡调节因子Bax改善了新物体位置范式和CFC表现，这与分配到记忆集群的新生神经元数量增加有关。这表明AD中记忆丧失的另一种假设：更少神经元被分配到印迹群体，可能与树突棘丢失有关，导致神经元缺乏分配所需功能特征。
4 未来展望——超越表观遗传可塑性与神经元兴奋性
除表观遗传可塑性作为决定神经元招募到印迹的新贡献者外，其他因素也可能发挥重要但未探索的作用，因为它们直接影响表观基因组。这些因素包括细胞代谢、其他细胞类型或外周影响，如激素信号、睡眠和肠道微生物组。
4.1 代谢作为表观遗传的上游因素
表观遗传机制与细胞代谢状态紧密耦合，提示代谢因素是基因表达及神经元功能的关键调节器。饱腹状态与高乙酰辅酶A水平相关，促进HAT活性，增加染色质可及性和转录激活。HDAC活性受氧化和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+/NADH）平衡调节。其他代谢物如α-酮戊二酸、三羧酸循环中间体影响组蛋白和DNA去甲基酶活性，乳酸通过组蛋白乳酸化介导基因转录。神经递质本身也可塑造表观遗传景观，如血清素和组蛋白多巴胺化。
4.2 其他细胞类型如星形胶质细胞和抑制性神经元
虽然大多数记忆分配研究聚焦兴奋性神经元，其他细胞类型如星形胶质细胞和抑制性中间神经元也可能参与此过程。破坏海马星形胶质细胞糖原代谢导致长时程记忆提取遗忘表型，此过程依赖于星形胶质细胞到神经元的乳酸转移，受损后学习后Arc和CREB减少，提示星形胶质细胞代谢功能与神经元分配间可能联系。腹侧海马印迹神经元和周围星形胶质细胞参与协调钙波标记记忆提取开始和结束。体抑素阳性（SST+）中间神经元通过侧向抑制周围颗粒细胞调节DG神经元记忆集群大小。发育中此中间神经元群体内表观遗传效应很重要，提示发育控制的中间神经元表观遗传调控网络兴奋性可能门控兴奋性神经元在印迹中的分配。
4.3 外周影响：激素、睡眠和肠道微生物组
雌激素或类固醇等激素是神经元兴奋性和表观遗传机制的强大调节器，注定影响记忆分配。发情周期中雌激素波动调节VTA多巴胺能神经元信号传导，此类波动兴奋性可能有表观遗传基础。应激激素波动可能偏倚不同生理状态下哪些神经元被分配到印迹集群。糖皮质激素受体（GR）信号对学习记忆的表观遗传调控有显著作用。急性应激通过沉积转录促进标记H3S10p和H3K14ac改善认知表现，而慢性糖皮质激素暴露通过GR结合Hdac2位点导致认知过程损伤。
睡眠影响神经元兴奋性，睡眠剥夺研究指出皮质兴奋性增加，而海马神经元兴奋性降低。DNA甲基化以昼夜模式波动，受睡眠剥夺影响，提示睡眠可能影响可用于分配的表观遗传景观。
肠道微生物组对神经元兴奋性有积极影响，给予益生菌和益生元增加海马兴奋性，改善认知表现。这些效应由丁酸盐（HDAC抑制剂）产生介导，提示表观遗传机制作为外周肠道微生物组影响的中介。
5 当前与未来研究工具箱
5.1 机制探究
蛋白质表达操作是研究特定蛋白质在记忆中作用的长期可靠方法。CREB在分配中作用的开创性研究通过HSV载体稀疏感染过表达野生型CREB（CREBWT）或显性负性突变体（CREBS133A）实现。光敏蛋白工具允许光控操作。除CREB外，其下游蛋白（如NMDA、钾钠通道、BDNF）在分配中的作用有待研究。病毒载体允许细胞类型和时序特异性靶向。CRISPR-Cas9及其酶死版本（dCas9）等基因编辑和转录控制新进展为剖析记忆分配分子机制提供了增强精度。兴奋性本身也可靶向操作。CREB和兴奋性介导的记忆分配仅在有限脑区研究，全脑研究将实现更大规模“分配图谱”。静脉AAV递送等系统导向方法可能特别有用。
5.2 小鼠模型
记忆分配涉及推定印迹细胞形成，为印迹研究设计的转基因小鼠系为研究分配神经元提供了宝贵工具。这些模型利用IEGs作为神经元活动代理。TetTag小鼠系广泛用于印迹识别，但研究长效变化时有限制。TRAP和改进的TRAP2小鼠利用IEGs驱动他莫昔芬依赖的Cre重组酶CreERT2表达，允许在推定印迹细胞中时序特异性表达荧光标记或任何floxed蛋白，由于永久转基因重组，允许长效标记。
5.3 功能操作
利用印迹技术，可通过化学遗传学和光遗传学方法轻松改变分配印迹细胞的神经元活动。最常用化学遗传学方法包括DREADD系统，与CREB过表达配对沉默偏倚印迹分配的神经元。其他化学遗传学操作包括Daun02失活法、TRPV1过表达、allostatin受体。光遗传学提供更精细时间窗口，使用光敏视蛋白快速可逆控制神经元活动。激活视蛋白如ChR2，抑制视蛋白如halorhodopsin已用于分配研究。新工具如ATAC（声靶向化学遗传学）利用全身递送AAV表达DREADD，结合聚焦超声血脑屏障开放（FUS-BBBO）定向AAV表达到特定脑区。闭路光遗传系统将光激光控制与动物实时冻结耦合，可进一步研究分配神经元在记忆形成中的因果关系。
5.4 分子探究
分配神经元的分子基础仍是领域内稀疏探索方向。主要挑战在于分配前识别这些神经元。当前证据和工具将增加IE和染色质动力学与优先招募联系起来，但此细胞池仍异质。未来研究应旨在理解是否有内源性驱动分配的特定因素。新技术如Ca2+split-TurboID（CaST）允许反向标记钙活动，与恐惧条件反射后cFos染色配对，可提供细胞内钙水平与细胞记忆分配招募间的相关性。
利用人工偏倚或CaST，可通过组学工具获得分配神经元分子基础的全面见解。基础分析水平是转录组学，提供与神经元分配相关分子景观的快照窗口。可在批量（批量RNAseq）进行，从细胞池（如分配印迹细胞）提取RNA，提供平均转录谱。IEG驱动转基因方法可用于标记印迹细胞用于后续分离。荧光激活细胞分选（FACS）是一种分离方法，但应用于神经元群体有限制。修改为分选核（FANS）可避免此问题。单细胞RNA测序（scRNAseq）提供更高敏锐度和群体异质性见解。
后续调查水平涉及表观基因组。染色质可及性变化可提供表观遗传动力学一瞥，已在批量或单细胞分辨率在印迹细胞中研究。与scRNAseq结合多组学测序实验提供记忆分配基础表观遗传-转录动力学的同步见解。DNA甲基化通过亚硫酸氢盐测序研究，以确定DNA上差异甲基化位点及其如何调控兴奋性和分配，而单核方法如单核甲基组测序（snmC-seq2）或多组学测序尚未用于分配研究。
关于蛋白质与染色质相互作用，分配领域研究很少。研究表观遗传标记及其写入器/擦除器占据的有用技术是染色质免疫沉淀（ChIP）。DNA interrogation可使用定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR）针对感兴趣基因组区域或下一代测序（ChIP-seq）用于蛋白质-染色质相互作用无偏图。ChIP-seq进一步可用于研究组蛋白翻译后修饰程度，鉴于组蛋白乙酰化和甲基化在记忆分配中的意义，此目标明确。尽管ChIP-seq有优势，其应用于印迹研究因需要大量细胞输入材料而受限。新开发技术如CUT&RUN和CUT&Tag减少了此限制因素，尤其CUT&Tag已用于单细胞分辨率，并可涵盖同一样本多个表观遗传标记分析，但尚未应用于分配研究。
超越蛋白质和组蛋白与染色质相互作用，Hi-C允许研究一般染色质架构。Hi-C涉及甲醛驱动交联共价键合DNA捕获其物理接触，通过深度测序读取以映射相互接触的基因组区域。这提供分配时染色质三维架构的额外信息，并已在记忆编码后其他阶段应用。更高分辨率技术如5C-seq为围绕感兴趣基因组位点的更高分辨率染色质接触图提供更多机会。基因组架构映射（GAM）克服某些限制。此外，允许通过荧光单细胞分辨率可视化染色质架构的技术，如ORCA利用寡核苷酸探针，为测序技术提供宝贵补充。这些技术以及功能操作3D染色质架构的方法尚未应用于记忆分配研究。
最后，任何表观遗传修饰也可通过调控负责表观遗传修饰的酶来研究。可通过传统敲低或过表达方法在定义分配相关细胞群体中实现，或使用CRISPR-dCas9表观遗传编辑方法。这些工具与表观遗传酶（如CBP）融合时，允许印迹特异性、位点解析、时间特异性过表达特定表观遗传玩家，从而能够功能 interrogation 细胞群体和特定位点用于记忆形成。
6 展望
显然，尽管记忆分配领域取得显著进展并应用各种技术，调查工具包仍需发展以为未来发现开门。例如，是否有方法直接桥接同一细胞内兴奋性与染色质变化？假设这可通过修改为包含ATAC-seq或CUT&Tag风格技术的Patch-seq实现。Patch-seq允许通过结合现有膜片钳技术与RNA测序分析IE和基因表达变化。若此劳动密集型技术能适应染色质分析，将保证在单细胞分辨率下IE与染色质变化联系的重要见解。
记忆分配中另一个未探索维度是更大系统神经科学水平方法。最近研究开始解决此问题，通过结合CREB过表达方法与逆行追踪证明互连网络，其中一脑区记忆分配直接影响另一脑区神经元分配。理解系统范围分配网络及一区域操作如何影响其他区域（甚至可通过测量操作细胞及其他脑区分子影响进一步研究）可极大改善领域知识。特别此类方法可澄清分配是局部现象还是依赖于整个大脑分布式过程的协调活动。
最终，推进记忆分配领域将需要转向整合框架，拥抱其多维性质。未来挑战不仅在于连接兴奋性与染色质状态或绘制互作集群网络，还将这些过程置于调控大脑的更广生理状态中。代谢状态、激素信号、睡眠、甚至肠脑轴通信都可能汇聚于偏倚印迹集群形成的分子和环路机制。同样，星形胶质细胞、抑制性中间神经元和其他非神经元伙伴的贡献仍
