一种次优的PAM驱动的单管CRISPR/Cas12a检测方法，可实现无需提取样本且超快速地检测非洲猪瘟病毒

《Sensors and Actuators B: Chemical》：A suboptimal PAM-driven one-tube CRISPR/Cas12a assay for extraction-free and ultra-rapid detection of African swine fever virus

非洲猪瘟病毒快速检测方法sCRAM整合无提取核酸释放与PAM介导CRISPR/Cas12a-MIRA等温扩增，20分钟内实现单拷贝灵敏度，特异性100%，适用于现场诊断。

　　

李晓辉|聂友|费思涵|文银忠|雷琦|杨波|张丁|牛瑞燕|孙子龙

山西农业大学兽医学院，中国晋中030801

摘要

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种高度传染性的猪病，其特征是接近100%的死亡率。由于缺乏有效的疫苗或治疗方法，目前的控制策略严重依赖于早期检测和迅速扑杀受感染的动物。在这里，我们开发了一种名为sCRAM（suboptimal protospacer adjacent motif (PAM)-mediated CRISPR RNA and Cas12a nuclease combined with multienzyme isothermal rapid amplification）的快速诊断平台，该平台能够在20分钟内检测出ASFV。sCRAM结合了快速核酸释放步骤（40°C，5分钟）和多酶等温扩增（MIRA）以及次优PAM介导的CRISPR/Cas12a系统（37°C，15分钟），无需仪器即可通过紫外光或侧向流动条（LFS）进行可视化读数。sCRAM显示出单拷贝检测的灵敏度，并且与五种常见的猪病原体（PRRSV、PPV、JEV、PCV和PRV）没有交叉反应。对111个模拟样本和临床样本（包括血液、血浆和拭子）的评估显示，紫外光读数的符合率为100%，侧向流动条读数的符合率为98.20%，两种方法的特异性均为100%。sCRAM的简单性、快速性和现场适应性凸显了其在资源有限环境中的潜力，为ASFV的分布式监测提供了强大的工具。

引言

非洲猪瘟（ASF）是一种高度传染性的病毒性疾病，由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起。该疾病通常表现为急性或亚急性病症，伴有高烧和持续广泛的出血[1]、[2]、[3]。该病毒可感染所有品种和年龄段的家猪和野猪，具有高传染性和致死性（95-100%）[1]、[4]、[5]。ASFV于1921年首次在肯尼亚被发现，此后在非洲、欧洲、东南亚和美洲引发了持续的疫情[6]。2018年8月，中国首次爆发疫情，随后迅速蔓延至全国[7]。迄今为止，ASFV仍然是全球范围内“导致猪死亡的主要杀手”[8]。世界动物卫生组织（WOAH）将ASF列为需报告的动物疾病[9]。2022年1月至2024年8月，共有61个国家和地区报告了ASF疫情，导致超过172.7万头猪死亡，严重影响了全球粮食安全和畜牧业[9]。然而，通过临床症状或尸检区分ASF和经典猪瘟（CSF）仍然具有挑战性[10]。目前尚无针对ASFV的靶向治疗方法或疫苗，因此早期检测和扑杀是控制疫情的主要措施[11]。因此，开发一种简单、快速、高度特异且灵敏的现场检测方法对于ASFV的早期监测、疫情控制和减少猪群的发病率和死亡率至关重要。

ASFV是一种大型、二十面体、双链DNA病毒（170-193 kbp），具有复杂的多层结构——包括外膜、衣壳、内膜、核心壳和核心——并编码150-167个开放阅读框（ORFs）[12]、[13]、[14]。B646L基因编码主要的衣壳蛋白p72，在不同ASFV分离株中高度保守且具有亚型特异性[15]，因此被广泛用作核酸检测的目标。目前的ASFV检测方法包括抗原/抗体检测和核酸扩增。由于ASF通常表现为急性或亚急性病症，且受感染的猪往往在血清转化前死亡，基于病原体的诊断方法至关重要。根据WOAH指南，主要的病原体检测技术包括病毒分离、血细胞吸附（HAD）检测和核酸检测[16]、[17]、[18]。病毒分离是金标准，但需要BSL-3级别的设施，无法用于快速或现场检测[17]。HAD检测具有高灵敏度和特异性，成本低，但依赖于原代细胞培养，且周转时间较长[16]。传统的PCR和实时定量PCR（qPCR）具有高灵敏度和特异性[18]，是中心实验室的首选方法，但依赖于昂贵的仪器、试剂和熟练人员，不适合在农场、海关或市场进行现场检测。

为了实现非洲猪瘟（ASF）的快速检测，研究人员开发了等温核酸扩增（INA）技术，包括环介导的等温扩增（LAMP）[19]、重组酶聚合酶扩增（RPA）[20]、重组酶辅助扩增（RAA）[21]和交叉引物扩增（CPA）[22]。与传统PCR相比，这些方法消除了对热循环仪的需求并缩短了检测时间。然而，它们受到非特异性扩增引起的假阳性、比PCR灵敏度低以及引物设计要求复杂等限制。

最近，由于CRISPR/Cas系统的卓越特异性，它们被用于核酸检测[23]。这些检测方法使用Cas9、Cas12、Cas13或Cas14核酸酶与引导RNA（gRNA）结合形成核糖核蛋白（RNP）复合物，这些复合物结合目标DNA或RNA序列并触发Cas介导的顺式切割[24]、[25]。同时，Cas核酸酶的旁路（反式）切割活性会降解附近的非目标核酸探针，从而增强检测信号[24]。通过将等温核酸扩增（INA）与CRISPR/Cas结合，研究人员实现了对寨卡病毒（ZIKV）、登革热病毒（DENV）、人乳头瘤病毒（HPV）和禽流感病毒（H7N9）等病原体的超灵敏检测[26]、[27]、[28]。尽管这些组合方法消除了对复杂仪器的需求并提高了灵敏度和特异性，但仍需要劳动密集型的样本裂解、纯化和富集步骤。此外，扩增和检测过程中的重复打开、试剂添加和移液步骤会增加气溶胶的产生，带来生物安全风险。为了克服这些限制，我们旨在开发一种超快速、无需提取且一锅完成的集成平台，用于现场检测ASFV，以最小化污染风险。

在这项研究中，我们开发了一种新的检测方法，称为sCRAM（suboptimal protospacer adjacent motif (PAM)-mediated CRISPR RNA and Cas12a nuclease combined with multienzyme isothermal rapid amplification），作为一种可用于现场检测ASFV的平台。sCRAM检测包括三个连续步骤：首先，使用快速等温核酸释放试剂处理临床样本，实现无需提取的样本制备，从而简化了分析前的工作流程；其次，通过工程化PAM寡核苷酸序列来减弱Cas12a的顺式切割活性，组装一个次优PAM介导的CRISPR RNA&Cas12a核糖核蛋白复合物，并将其与多酶重组酶介导的等温扩增（MIRA）结合，实现一管式ASFV检测；第三，在紫外光照射或侧向流动条（LFS）下可视化扩增产物，允许肉眼解读结果。在111个临床样本的测试中，整个sCRAM工作流程（包括样本处理、核酸检测和信号读数）在20分钟内完成。结果与qPCR完全一致，灵敏度为100%（20/20），特异性为100%（91/91）。sCRAM提供了一种快速、仪器需求少、可现场部署的平台，是ASFV现场监测的有前景的技术，并且可以轻松适应其他病原体的即时核酸检测。

材料

ASFV质粒由Sangon Biotech（中国上海）合成。HiScribe T7快速高产RNA合成试剂盒和RNase抑制剂购自New England Biolabs（中国北京）。DNA等温快速扩增试剂盒购自Amp Future Biotech（中国常州）。LbaCas12a和侧向流动条购自Tolo-Biotech（中国上海）。非洲猪瘟核酸检测试剂盒来自SVDM Biotech（中国长沙）。2X M5 HiPer SYBR...

sCRAM的工作原理

sCRAM检测方案（图1）包括三个连续步骤：（1）使用快速释放试剂进行无需核酸提取的样本制备；（2）一管式整合次优PAM介导的CRISPR/Cas12a核酸酶与MIRA；（3）通过紫外光或侧向流动条（LFS）进行结果可视化。为了评估其在现场条件下的适用性，测试了三种类型的临床样本（血液、血浆和拭子）。

讨论

ASFV的全球传播严重威胁了猪肉生产系统，危及了全球的粮食安全[32]。在缺乏许可疫苗或抗病毒疗法的情况下，控制策略严重依赖于快速诊断和扑杀受感染的猪群[12]、[33]。然而，早期ASFV感染的表现是非特异性的临床症状，与其他猪热性疾病难以区分，而传统的血清学检测方法具有较长的诊断窗口期

结论

在这项研究中，我们开发了sCRAM，这是一种快速且可现场部署的ASFV检测平台，结合了次优PAM介导的CRISPR/Cas12a和多酶等温扩增。该检测方法在20分钟内可实现单拷贝/微升的灵敏度，并且与主要猪病原体无交叉反应。通过对血液、血浆和拭子样本的临床验证，使用紫外光读数的符合率为100%，使用侧向流动条的准确率为98.20%。

CRediT作者贡献声明

孙子龙：监督、方法论、概念设计。张丁：撰写——初稿。牛瑞燕：正式分析、数据管理。聂友：撰写——初稿、方法论、调查、正式分析。费思涵：验证、资源管理、数据管理。李晓辉：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、正式分析、概念设计。雷琦：可视化、资源管理、项目协调。杨波：撰写——初稿、软件开发。文银忠：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了现代农业技术研究系统（编号：2025CYJSTX12-10）、山西省研究生实践与创新项目（编号：2025SJ001）以及山西省科技创新团队（编号：202304051001041）的专项资助。

李晓辉是山西农业大学兽医学院的博士候选人（2024年），他的研究重点是动物疾病的诊断和治疗。