霉菌毒素是有毒化合物，对人类健康有害，由真菌物种作为次级代谢产物产生[[1], [2], [3]]。在已知的霉菌毒素中，黄曲霉毒素是最有害和致癌的，国际癌症研究机构将其列为I类致癌物[4,5]。目前已发现并鉴定出20多种黄曲霉毒素亚型，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）对人类危害最大[6]。食品中的AFB1不仅会造成身体伤害，还会导致重大经济损失[7]。为保证食品安全，许多国家和组织制定了严格的标准和监管措施来限制AFB1的含量[8]。因此，开发灵敏高效的AFB1检测技术至关重要[9]。目前，AFB1的常用检测方法主要包括色谱技术和ELISA[10,11]。基于色谱的方法在AFB1检测中显示出高可靠性和灵敏度，但通常存在某些局限性（例如，检测设备昂贵、需要专业操作人员以及复杂的样品预处理程序[12,13]。ELISA检测AFB1也有一定局限性，如成本高和单克隆抗体制备复杂[10]。因此，迫切需要开发新型检测技术，以实现便携、快速和低成本的AFB1检测。
CRISPR及其相关蛋白（CRISPR/Cas）（例如CRISPR/Cas12a）作为一种新兴的强大基因编辑工具，已广泛应用于生物传感器的设计和开发[14,15]。在程序化CRISPR RNA（crRNA）的引导下，CRISPR/Cas12a系统可以精确识别含有PAM位点的目标DNA，启动Cas12a蛋白的切割活性[16,17]。由于其高选择性、crRNA易于生产以及能够精确靶向和切割核酸的能力，基于CRISPR/Cas的生物传感平台已应用于多个领域，包括分子诊断和核酸检测（例如病原体[18,19]。最近，基于CRISPR/Cas的生物传感平台也被用于非核酸目标的检测[[20], [21], [22], [23], [24], [25]]。例如，Xiang等人基于CRISPR/Cas12a介导的信号转导策略，开发了一种新型的功能性DNA引导的过渡态CRISPR/Cas12a微流控生物传感器，实现了高灵敏度和高通量的霉菌毒素检测[24]。Ma等人通过探索适配体对AFB1的识别机制，合理建立了CRISPR/Ca12a与Exo III耦合的AFB1检测平台[25]。为了实现高灵敏度，大多数基于CRISPR/Cas的核酸检测方法需要对目标进行预扩增[26]。由于等温扩增具有快速、简单和高效的信号放大优势，通常将其与CRISPR/Cas检测方法结合使用以提高检测灵敏度[27,28]。链置换扩增（SDA）被认为是一种高效的线性扩增方法，其扩增产物可以触发指数级扩增反应（EXPAR）。基于SDA和EXPAR的级联扩增可以弥补单次扩增反应的灵敏度和特异性不足[4]。因此，这种多重等温扩增方法对于提高CRISPR/Cas检测方法的灵敏度非常有前景。
此外，高效的信号探针对于提高基于CRISPR/Cas的检测方法的灵敏度非常重要[29]。目前，大多数基于CRISPR/Cas的荧光检测方法使用荧光团和淬灭剂双标记的荧光探针来产生检测信号[30]。荧光共振能量转移（FRET）在核酸酶消化过程中发光，恢复的荧光反映了目标的丰度[31]。尽管FRET易于测量且操作简单，但需要在两端进行双重标记，这使得制造过程繁琐且成本较高[30]。此外，FQ探针通常具有较高的背景信号和较差的光稳定性[32]。因此，为了提高CRISPR/Cas检测系统的灵敏度和可靠性，仍需开发廉价可靠的荧光纳米探针。一种独特的极小荧光纳米材料是贵金属纳米簇[33]。这些贵金属纳米簇具有许多优点（例如，大表面积、优异的光学性质和高摩尔吸附率），并且已经设计了多种类型的生物分子作为其合成模板（如肽、蛋白质和核酸[34,35]。其中，DNA寡核苷酸作为引导金属纳米簇成核的理想支架，因其独特的优点（例如，相对简单的构象、特定的分子识别性质和可调的序列结构）而受到特别关注[36,37]。基于DNA的金属纳米簇由于其优势（例如，高亮度、光稳定性、良好的生物相容性和易于合成以及发射颜色的调节）成为DNA生物分析的强大探针[36,37]。因此，已经开发了多种不同的DNA模板金属纳米簇，包括铂纳米簇、铜纳米簇、金纳米簇和合金纳米簇[36]。近年来，荧光铜纳米颗粒因其优势（例如，低成本、优异的光学性质和简单的合成方法）而受到广泛研究[38]。此外，CuO作为一种具有优异物理化学性质的稳定材料[39,40]。特别是DNA模板铜纳米簇（DNA-CuNCs）因其独特的优势（例如，低成本、几分钟内快速合成、出色的光学特性和较大的斯托克斯位移[41,42]）而备受关注。所有这些优点使DNA-CuNCs成为分析检测领域中出色的金属纳米荧光探针，为构建高灵敏度的纳米生物传感系统提供了有希望的策略。例如，Wu等人使用富含腺嘌呤胸腺嘧啶（AT）的单链DNA（ssDNA）作为模板成功合成了荧光CuNCs[43]。此外，Zhang等人使用抗坏血酸作为还原剂和富含AT的互补双链茎作为模板合成了荧光CuNCs[44]。因此，荧光DNA-CuNCs在构建基于CRISPR/Cas12a的荧光生物传感平台方面显示出巨大潜力。
在这项工作中，基于发光的DNA-CuNCs和多重等温扩增系统，开发了一种基于CRISPR/Cas12a的无标记荧光生物传感平台，用于超灵敏的AFB1检测。如图1所示，当AFB1存在时，适配体-cDNA复合物从磁珠（MB）上释放出cDNA（P），启动随后的SDA/EXPAR过程。释放的P序列可以与模板链（P′-Q′序列）结合，并在内切酶和DNA聚合酶的催化下进行SDA扩增，得到Q序列。然后，Q序列进行EXPAR扩增并与其他模板链（Q′-Q′序列）结合，生成大量Q序列。扩增产物（Q序列）触发了CRISPR/Cas12a系统的切割活性，降解ss-DNA链并抑制DNA-CuNCs的形成，从而发出最小的荧光。本研究中合成的DNA-CuNCs用于构建Cas12a介导的荧光生物传感器，使其具有高灵敏度。此外，DNA-CuNCs可以从无标记DNA单链合成，并且可以在5分钟内快速合成，无需复杂的设备或苛刻的反应条件。通过将多重等温扩增技术与基于发光DNA-CuNCs的荧光生物传感器结合，所建立的方法有望实现简单、快速且无需标记的AFB1检测。
