基于改进生物量测定方法的球孢白僵菌吸附载体固态发酵工艺优化与生长动力学模型构建

《Fermentation》：Adsorbed Carrier Solid-State Fermentation of Beauveria bassiana: Process Optimization and Growth Dynamics Modelization Based on an Improved Biomass Determination Method

本文系统研究了以稻壳为惰性载体的吸附载体固态发酵（ACSSF）技术优化球孢白僵菌（Beauveria bassiana）发酵工艺。通过结合均质化与超声处理的样品前处理方法改进，显著提升了生物量检测精度（RSD低至3.32%-3.75%）。研究筛选出最佳碳源（木薯淀粉）与氮源（玉米浆干粉，CSLP），并利用人工神经网络（ANN）结合遗传算法（GA）优化获得最优培养基配方，使生物量产量提升45.0%。基于Logistic模型的生长动力学拟合优度（R2=0.9525）验证了以总生物量构建球孢白僵菌生长动力学模型的可行性，为微生物杀虫剂工业化生产提供了重要技术支撑。

　　

引言部分阐述了球孢白僵菌作为一种广泛应用的微生物杀虫剂，其分生孢子制剂在生物制造和植物保护领域具有重要价值。固态发酵（SSF）是生产球孢白僵菌分生孢子的重要方式，其杀虫活性高于液态发酵（SmF）产生的芽生孢子。然而，SSF过程中生物量的准确测定是一个技术难点，因为微生物与饲料颗粒难以分离，传统方法如光密度（O.D.）和干细胞重量（D.C.W.）不适用。间接方法，如检测几丁质特有的组分葡萄糖胺含量，成为主流方法，但样品颗粒不均匀易引入较大误差。因此，改进样品前处理工艺，提升样品均匀性至关重要。吸附载体固态发酵（ACSSF）通过使用稻壳等刚性颗粒作为惰性载体，增加了发酵床的孔隙度，有利于热量和水分传递，但以往研究多将稻壳作为唯一培养基而未补充其他营养物质。本研究旨在开发一种适用于球孢白坚菌分生孢子生产的ACSSF培养基，并利用人工神经网络（ANN）等人工智能技术优化工艺，同时基于总生物量含量构建微生物生长动力学模型。

材料与方法部分详细介绍了实验流程。研究所用菌株为球孢白僵菌ACCC30736，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）。ACSSF实验在250 mL锥形瓶中进行，以干燥稻壳为载体。通过单因素实验筛选最佳碳源（豌豆淀粉、玉米淀粉、甘薯淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉）和氮源（玉米浆干粉CSLP、大豆蛋白胨、大豆分离蛋白、豆粕粉、玉米蛋白粉），并优化其用量以及水分含量和接种量。随后采用中心复合设计（CCD）实验，并利用ANN模型（输入层3个神经元，隐藏层4个神经元，输出层1个神经元）结合遗传算法（GA）进行优化，以Levenberg-Marquardt反向传播（LMBP）算法训练网络，以均方误差（MSE）最小化为目标。微生物生长动力学模型采用Logistic模型，通过非线性回归拟合生长曲线数据。样品前处理方法在干法粉碎基础上，结合了转子-定子均质器均质和超声处理，并使用激光粒度分析仪评估处理效果。生物量测定采用MBTH法，通过酸水解样品释放葡萄糖胺，与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐（MBTH）发生显色反应，测定650 nm波长下的吸光度，根据葡萄糖胺标准曲线计算生物量。

结果部分展示了主要研究发现。在改进ACSSF样品前处理方法方面，单纯延长均质时间至10分钟才能显著降低大颗粒（100–1000 μm）含量；而均质10分钟后结合超声处理30分钟的方法效果最佳，能生成最多的小颗粒（2–20 μm）。基于此改进方法，MBTH法的日内和日间精密度相对标准偏差（RSD）分别低至3.32%和3.75%，方法学评价良好。单因素优化结果表明，在五种碳源中，高粘附性的木薯淀粉能获得最高生物量产量（0.0951 g·cm^?3）；其最适用量为0.025 g·cm^?3，过量会因水分含量降低而减少产量。在氮源筛选中，尽管玉米浆干粉（CSLP）蛋白质含量最低，但其生物量产量最高，且成本低廉，故被选为最佳氮源；但其用量超过0.006 g·cm^?3时会产生抑制。水分含量优化显示0.25 g·cm^?3为最适水平。接种量大于初始量（I₀）的1/8时对最终生物量产量无显著影响。ANN-GA优化最终得到最优培养基配方为：木薯淀粉0.0314 g·cm^?3，CSLP 0.004885 g·cm^?3，水0.2630 g·cm^?3。验证实验测得生物量产量为0.1379 g·cm^?3，较优化前原始配方（0.0951 g·cm^?3）提高了45.0%，且ANN模型各数据集相关系数（R）均高于0.92，预测效果良好。对ACSSF过程动力学分析发现，发酵0-24小时水分快速蒸发（1.44%/天），24-72小时水分蒸发极慢（0.10%/天），且此阶段未见微生物生长。72小时后生物量开始快速增长，进入对数生长期，132小时后进入稳定期和衰亡期，最佳发酵时间为5.5天。利用Logistic模型对生长曲线进行非线性回归，得到模型参数：初始生物量X₀= 0.0054 g·cm^?3，最大生物量X_m= 0.1133 g·cm^?3，比生长速率μ = 0.0588 h^?1，拟合决定系数R²高达0.9525，残差绝对值完全低于0.003 g·cm^?3，模型拟合效果理想。

讨论部分对实验结果进行了深入分析。均质处理时间需达到10分钟才能有效破碎刚性稻壳大颗粒，原因可能在于前期处理使颗粒软化并剥离表面附着物，从而更容易进入均质器间隙被破碎。改进的样品前处理方法（干法粉碎结合湿法均质和超声）有效提高了ACSSF样品的均匀性，为后续准确的生物量测定、工艺优化和模型构建奠定了基础。玉米浆干粉（CSLP）作为廉价氮源，其含有的有机酸可能是高剂量下抑制球孢白僵菌生长的主要原因。以稻壳为载体的ACSSF系统中，过量水分易在光滑的稻壳表面形成水膜，影响氧气传递，从而抑制生长；而木薯淀粉的高粘附性有助于营养介质负载于稻壳表面，从而提高生物量产量。ANN-GA优化方法成功应用于ACSSF培养基优化，显著提升了生物量产量。基于总生物量含量（而非单纯分生孢子产量）构建的生长动力学模型能更全面地反映丝状真菌球孢白僵菌在整个发酵过程中的生长状况，Logistic模型的成功拟合验证了该研究策略的可行性。该研究为球孢白僵菌微生物杀虫剂的工业化生产，特别是在降低培养基成本（使用CSLP）和解决固态发酵放大过程中床层均一性方面提供了重要参考。

结论部分总结道，改进的样品前处理方法有效提升了ACSSF样品均匀性和MBTH法检测精度。通过单因素实验和ANN-GA优化，获得了球孢白僵菌ACSSF的最佳培养基配方，显著提高了生物量产量。基于总生物量数据构建的Logistic生长动力学模型拟合良好，验证了改进的检测方法及以总生物量建模生长动力学的可靠性，为相关研究和工业应用提供了有力工具。