《iScience》：Spectrin condensates provide a nidus for assembling the axonal membrane-associated periodic skeleton
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本研究针对轴突膜相关周期性骨架(MPS)的组装机制尚不明确的问题，通过活细胞成像、超分辨显微镜及生物物理分析，发现发育轴突远端富含spectrin/adducin但缺乏F-actin的斑块具有生物分子凝聚体特性。过表达spectrin重复序列可诱导相分离，破坏其与肌动蛋白的结合可促进凝聚体形成，而肌动蛋白的掺入驱动MPS成熟。该研究提出了“凝聚-组装”模型，为细胞骨架自组织机制提供了新见解。
在神经元中，轴突膜下方存在一种由α/β-spectrin、adducin和肌动蛋白纤维规则排列形成的膜相关周期性骨架（Membrane-associated Periodic Skeleton, MPS），其周期约为190纳米。这种结构不仅为轴突提供机械支撑，还参与信号传导和轴突直径调控等重要生理功能。然而，在轴突生长过程中，MPS组分需通过慢速轴突运输从胞体远距离输送至轴突 shaft，且远端轴突缺乏明显的模板结构，MPS如何在此环境下有序组装成周期性 lattice 仍是一个悬而未决的问题。此前有研究提出“近端向远端传播”模型或“远端斑块 coalescence 模型”，但均缺乏直接证据。
为揭示MPS组装机制，Nicholas P. Boyer、Rohan Sharma、Christophe Leterrier和Subhojit Roy等团队合作，通过系统观察发育中 hippocampal 神经元的MPS组分分布，发现远端轴突存在富含spectrin和adducin、但肌动蛋白稀疏的斑块。这些斑块具有生物分子凝聚体（biomolecular condensates）的特征：形态学上呈 mesoscopic 聚集，荧光漂白恢复（FRAP）实验显示其内部分子可与周围胞质交换，且过表达spectrin的 coiled-coil 重复结构域可在非神经元细胞中诱发类似液-液相分离的液滴形成。进一步实验表明，破坏βII-spectrin与肌动蛋白或膜的结合能促进其相分离，而在神经元中过早过表达凝聚体形成的spectrin重复片段会干扰内源性MPS的周期性组装。相反，过表达肌动蛋白可增强远端轴突中spectrin的连续性，提示肌动蛋白的掺入是MPS成熟的关键步骤。基于这些发现，研究者提出了“凝聚-组装”模型：spectrin重复序列通过相分离在轴突远端形成凝聚体，作为储存MPS组分的“仓库”；随后肌动蛋白的逐渐募集和聚合促使spectrin/adducin从凝聚体转移至膜下肌动蛋白网络，最终形成稳定的周期性骨架。该模型不仅解释了MPS在缺乏模板的轴突环境中如何自组装，也揭示了相分离在细胞骨架构建中的普适性作用。
研究主要采用了以下关键技术：原代海马神经元培养与免疫荧光染色、活细胞旋转盘成像与荧光漂白恢复（FRAP）、随机光学重建显微镜（STORM）和结构光照明显微镜（SIM）超分辨成像、以及在HEK293T细胞中过表达spectrin/adducin结构域并利用MOCHA-FRAP量化相分离行为。这些技术相结合，实现了从纳米尺度动态观测到生物物理定量的多维度分析。
Distal axons contain patches of spectrins and adducin that have sparse actin filaments
通过免疫荧光染色发现，在发育早期（2 DIV），spectrin和adducin主要富集在轴突近端（AIS附近），而到7 DIV时，远端轴突出现明显的spectrin/adducin斑块。这些斑块大小约3.76微米，间隔约2.64微米，且越靠近远端斑块密度和尺寸越小。STORM超分辨成像显示，近端轴突具有连续的~190纳米周期性spectrin lattice，而远端斑块内spectrin呈不完全的环状或 globular 结构，且肌动蛋白并未共组织。
Spectrin patches in distal axons show condensate-like behavior
活细胞成像显示，远端轴突的αII-spectrin:mGL斑块在15分钟内稳定存在，不发生融合或分裂。FRAP实验表明，远端斑块中的荧光可部分恢复（分子与周围轴质交换），而近端成熟MPS区域恢复极低，提示远端斑块具有动态交换特性，符合生物分子凝聚体的典型特征。
αII-spectrin can form bimolecular condensates in heterologous cells
在HEK293T细胞中过表达全长αII-spectrin可形成液滴状 inclusion，其FRAP和MOCHA-FRAP（dip-depth ~19.1%）均支持相分离行为。对照实验显示，已知相分离蛋白RGG-GFP-RGG也呈现类似液滴特性，而固定细胞无恢复。
Spectrin repeats can form biomolecular condensates in heterologous cells
域缺失实验表明，缺失SH3结构域（ΔSH3）或仅表达spectrin重复序列（SR5-20）的αII-spectrin仍可形成凝聚体，且MOCHA-FRAP dip-depth（ΔSH3: 18.2%; SR5-20: 21.5%）落在相分离预测范围内。内部扩散系数计算显示，缺失N/C末端或SH3结构域可提高液滴内部分子运动速率。
Eliminating actin and membrane-binding domains of βII-spectrin facilitates condensate-formation
全长βII-spectrin在HEK293T中主要定位于膜结构，但删除其肌动蛋白结合域（ΔCH-CH）或仅表达spectrin重复序列（SR1-17）后可诱导凝聚体形成。Latrunculin A破坏肌动蛋白后，全长βII-spectrin亦从膜分布转为凝聚体，且MOCHA-FRAP dip-depth（22.3%）支持相分离。这些结果说明spectrin与肌动蛋白/膜的结合抑制了其相分离倾向。
Early overexpression of condensate forming spectrin-repeats disrupt endogenous MPS assembly
在神经元MPS组装期（3 DIV）过表达βII-spectrin重复序列（SR1-17）会在胞体形成大型凝聚体，并招募内源性spectrin和肌动蛋白，但排除adducin。SIM成像显示，该处理显著破坏近端轴突的MPS周期性；而在MPS已建立的7 DIV后过表达则影响较小，说明相分离过程对MPS的正常组装具有时序敏感性。
研究结论指出，spectrin通过其 coiled-coil 重复结构域发生相分离，在远端轴突形成凝聚体斑块，作为MPS组分的局部储存库；肌动蛋白的逐步掺入则驱动这些斑块向稳定周期性骨架转变。该“凝聚-组装”模型不仅解释了MPS在轴突生长过程中的自组织机制，也强调了相分离在细胞骨架构建中的重要作用。此外，远端轴突中保留的凝聚体可能为轴突可塑性提供结构基础。该研究为理解细胞骨架的高度有序组装提供了新范式，并提示相分离可能是多种细胞骨架结构形成的普遍机制。
