利用黑色素瘤细胞膜伪装的双重抗氧化和抗炎活性无载体纳米组装技术，用于阿尔茨海默病的Tau蛋白靶向治疗

《Biomaterials》：Carrier-Free Nanoassembly with Dual Antioxidant and Anti-inflammatory Activities Camouflaged by Melanoma Cell Membrane for Tau-Targeted Therapy of Alzheimer's Disease

针对阿尔茨海默病（AD）的病理特征，本研究开发了一种新型载体-free硒基纳米复合物FSMT。该纳米体通过FTY720的羟基富集特性实现稳定化，并经B16F10黑色素瘤细胞膜伪装和T807靶向修饰，显著增强血脑屏障穿透能力及磷酸化tau蛋白（p-tau）靶向性。实验证实FSMT通过GSK-3β和NF-κB信号通路协同发挥抗氧化和抗炎作用，有效抑制tau超磷酸化并改善AD模型小鼠的认知功能障碍，且其载体-free设计和仿生膜包裹技术具有临床转化潜力。

　　

瑞雪|王凤宇|张蓓蓓|吴金|张宁楠楠|孙春阳

天津医科大学总医院放射科与天津功能影像重点实验室，中国天津市300052

摘要

针对穿过血脑屏障（BBB）的磷酸化tau（p-tau）是减轻阿尔茨海默病（AD）中的tau病理和疾病进展的关键前提，这可以通过缓解氧化应激和神经炎症来实现。为了解决这一挑战，我们开发了一种新型的无载体硒基纳米组装体，该纳米组装体由富含羟基的fingolimod（FTY720）稳定，FTY720是一种鞘氨醇类似物。经过与黑色素瘤细胞膜伪装处理并进一步用T807功能化后，所得到的纳米复合物（FSMT）在体外和体内均表现出强大的穿越BBB的能力，并能靶向p-tau。此外，FTY720和纳米硒通过调节GSK-3β和NF-κB信号通路分别发挥显著的抗氧化和抗炎作用，从而减轻tau过度磷酸化并防止神经元死亡。在okadaic酸诱导的AD小鼠模型中，FSMT治疗不仅显著改善了氧化应激和神经炎症，还改善了空间学习和记忆障碍。治疗后异常tau聚集的减少通过PET-CT成像得到了证实。总体而言，这种靶向p-tau的仿生纳米复合物表现出优异的生物相容性和治疗效果，为通过类似机制治疗AD和其他神经系统疾病提供了一种可转化的策略。

引言

阿尔茨海默病（AD）的特点是认知功能逐渐下降，是最常见的与年龄相关的神经退行性疾病之一。¹据估计，目前全球有超过5500万人患有AD或其他痴呆症，而且这一数字正在迅速增加。²这一增长给全球带来了巨大的经济和社会负担。AD的标志性病理特征主要包括β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积和神经纤维缠结（NFTs）的形成，而NFTs由过度磷酸化的tau（p-tau）蛋白组成。^{3, 4}AD的治疗策略通常集中在这两个病理特征上。然而，几乎所有针对Aβ相关病理位点的有希望的药物候选物在临床试验中都未能取得满意的结果。^{5, 6, 7}在AD患者的大脑中，tau过度磷酸化导致其从微管上脱落并聚集形成NFTs，这是AD病理进展中的核心事件，最终导致神经元功能障碍。⁸先驱性研究表明，tau相关的病理与患者的认知衰退和记忆障碍密切相关。⁹由于与AD相关的氧化应激损伤可以通过降低p-tau蛋白水平来缓解，因此靶向tau的疗法预计会比靶向Aβ的疗法提供更直接和有效的好处。^{10, 11}鉴于这些发现，靶向p-tau蛋白并抑制其磷酸化过程作为AD的更有效治疗手段具有巨大潜力。

Tau过度磷酸化与氧化应激和神经炎症密切相关。氧化应激激活特定的激酶，这些激酶调节tau的磷酸化，导致其过度磷酸化。^{12, 13}氧化应激产生的自由基可以直接与tau相互作用，促进更容易聚集的tau寡聚体的形成，从而促进NFT的形成。¹⁴神经炎症也在AD的进展中起着关键作用。具体来说，活化B细胞的核因子κ-light链增强子（NF-κB）信号通路作为关键调节因子，促使小胶质细胞向促炎M1表型极化。^{15, 16}这种极化导致炎症细胞因子的释放，从而通过增强tau过度磷酸化加剧神经元损伤。¹⁷因此，针对p-tau的治疗策略可能受益于结合抗氧化和抗炎方法。

硒是人体中必需的微量元素，通过硒蛋白（如谷胱甘肽过氧化物酶）在抗氧化防御中发挥重要作用，这些蛋白维持氧化还原平衡并保护细胞免受氧化损伤。^{18, 19}硒还参与调节免疫反应，并通过调节活化巨噬细胞中的炎症基因和信号转导通路来缓解慢性炎症。²⁰迄今为止，由于硒纳米颗粒具有增强的生物活性、改善的生物利用度和低毒性，它们已成为治疗神经系统疾病（如AD、帕金森病和脊髓损伤）的有希望的治疗策略。^{21, 22, 23}不幸的是，传统的硒纳米颗粒合成方法通常使用富含羟基的多糖作为稳定剂，这使得难以封装小分子载荷，从而限制了它们在联合疗法中的应用。^{24, 25}Fingolimod（FTY720）是一种鞘氨醇类似物和S1P受体调节剂，已被证明可以通过神经保护作用（包括调节神经发生、炎症和凋亡）来减缓AD的进展。^{26, 27}更重要的是，FTY720丰富的羟基表明其作为稳定剂的潜力，可用于合成无载体的含硒纳米组装体，从而通过协同机制增强AD治疗。

实现精确有效的药物递送至神经元和胶质细胞是AD治疗的另一个主要挑战，因为血脑屏障（BBB）阻碍了常用治疗剂进入脑实质。^{28, 29}幸运的是，脑转移癌细胞的固有BBB穿透能力激发了开发伪装其膜的仿生纳米颗粒以促进药物递送到颅内AD病灶的灵感。^{30, 31}这些纳米载体可以通过破坏脑血管内皮细胞的紧密连接、与内皮细胞粘附分子相互作用或利用内皮细胞上的运输通道来有效绕过BBB。^{30, 31, 32, 33}B16F10黑色素瘤细胞系是研究动物模型中脑转移的成熟模型。^{34, 35}其商业可用性、标准培养要求和快速增殖能力使得细胞膜制备高效。此外，AD模型通常在C57BL/6J小鼠中建立，而源自该品系的B16F10细胞系非常适合AD治疗。

在这项研究中，我们构建了一种用B16F10黑色素瘤细胞膜伪装的无载体纳米组装体，并进一步用T807进行功能化，T807是目前临床PET成像中用于靶向p-tau的活性配体（图1）。^{36, 37}这种具有抗氧化和抗炎特性的功能性纳米FSMT是通过SeO₃^2-和FTY720之间的温和、简便的一步还原反应合成的。³⁶静脉注射后，获得的FSMT成功穿越了BBB并精确靶向神经元中的p-tau蛋白。在神经元内，FSMT中的FTY720和硒通过调节GSK-3β和NF-κB信号通路减轻了氧化应激和炎症损伤。这种调节通过减少tau过度磷酸化显示出对抗AD的显著治疗潜力，并防止神经元死亡。此外，FSMT促使小胶质细胞向抗炎M2表型极化，从而减轻神经炎症。体外和体内实验均表明，FSMT抑制了tau磷酸化，并显著改善了AD模型小鼠的空间学习和记忆缺陷。与报道的通过抗炎、抗氧化和抗tau磷酸化途径组合治疗的纳米药物相比，我们的系统具有无载体且易于合成的设计（表S1）。^{4, 11, 21, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43}此外，它还表现出自主的BBB穿透能力和静脉给药后的特异性p-tau靶向。这种策略为通过实现主动和精确的药物递送提供了治疗AD的新途径。

章节片段

用各种稳定剂功能化的硒纳米颗粒的合成

FTY720稳定的硒纳米组装体（FS）是通过将Na₂SeO₃溶液（2 mg/mL，2 mL）与FTY720溶液（16 mg/mL，1 mL）混合，然后在搅拌下逐滴加入抗坏血酸溶液（1.5 mg/mL，27 mL）制备的。混合物连续搅拌24小时后，通过11,000 rpm离心10分钟获得纳米颗粒。

壳聚糖稳定的硒纳米颗粒（CS）按照先前报道的程序合成。²⁴标记有Cy5.5的FS（^Cy5.5

FSMT的合成与表征

硒纳米颗粒的合成通常涉及多糖修饰，其中丰富的羟基与SeO₃^2-反应形成稳定的链状中间体，随后这些中间体被还原为球形硒纳米颗粒。^{25, 45}尽管多糖在稳定过程中起着重要作用，但它们本身缺乏治疗效果，还可能导致小分子药物的封装效率降低。相比之下，FTY720是一种S1P受体

结论

总结来说，我们成功制备了一种用黑色素瘤细胞膜伪装的无载体纳米组装体，用于靶向p-tau的AD治疗，该纳米组装体通过抗氧化和抗炎机制减轻了tau过度磷酸化。通过在硒纳米颗粒合成过程中使用FTY720作为稳定剂，FSMT表现出增强的治疗效果。黑色素瘤细胞膜的伪装延长了纳米颗粒的循环时间，并提高了它们穿越BBB的能力

CRediT作者贡献声明

张蓓蓓：可视化、形式分析、数据管理、资金获取。王凤宇：撰写——初稿、可视化、验证、软件使用、方法学、研究、形式分析、数据管理。吴金：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督、资源获取、概念化。孙春阳：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、验证、监督、方法学、资金获取、概念化。

利益冲突

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致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：82171995、82071907）、天津市自然科学基金（编号：25JCLMJC00020）、天津市重点医学学科建设项目（TJYXZDXK-3-008C）、河南省卫生健康委员会（编号：LHGJ20230264）以及天津医科大学总医院优秀青年科学家基金（编号：22ZYYYQ02）的支持。