经过工程改造的非典型还原型三羧酸（TCA）代谢途径显著提升了Yarrowia lipolytica（解脂耶罗菌）中琥珀酸的高产率生物合成

《Metabolic Engineering》：Engineered non-canonical reductive TCA pathway drives high-yield succinic acid biosynthesis in Yarrowia lipolytica

丁二酸生物合成通过非经典还原三羧酸循环代谢工程优化，解决了传统rTCA途径中NADH依赖导致的红ox失衡问题，在Yarrowia lipolytica中实现98.16 g/L的高产率和0.91 g/g葡萄糖产率，并验证了在木质纤维素水解液和甘油中的适用性。

　　

陶慧琳|郝傲梅|潘晓月|钟宇涛|崔志勇|齐庆生

中国山东省青岛市山东大学微生物技术国家重点实验室，邮编266237

摘要

还原性三羧酸（rTCA）循环是微生物生产C4-二羧酸（尤其是琥珀酸（SA）的关键代谢途径。然而，该循环固有的氧化还原限制对SA的产量产生了显著影响。在这里，我们通过在油酵母Yarrowia lipolytica中工程化一种非经典的还原性TCA（Nc-rTCA）途径来解决这一关键瓶颈。我们的方法用一种由天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨裂解酶和谷氨酸脱氢酶组成的工程级级联反应，替代了天然rTCA循环中依赖NADH的草酰乙酸转化为富马酸的过程，从而有效地将SA的合成与NADH的限制解耦。这种依赖NADPH的模块使富马酸的产量提高了1.28倍。在工程菌株Ncr12中进一步优化代谢后，减少了苹果酸副产物的生成，在5升生物反应器中实现了98.16克/升的SA产量和0.91克/克的葡萄糖产率。重要的是，Nc-rTCA途径展示了工业应用的潜力，从木质纤维素水解物中可生产出74.34克/升的SA（葡萄糖产率为0.98克/克），从甘油中可生产出117.74克/升的SA（葡萄糖产率为0.74克/克）。我们的发现解决了长期以来困扰基于rTCA的工程化的氧化还原不平衡问题，并建立了一个可扩展的生物基C4-二羧酸生产平台。

引言

还原性三羧酸（rTCA）循环，也称为逆向三羧酸循环，其运行方向与传统TCA循环相反，主要存在于某些厌氧细菌和古菌中。rTCA循环在某些生态系统中的碳循环中起着重要作用，并为某些微生物提供了合成高价值C4-二羧酸（如苹果酸、富马酸和琥珀酸）的新途径（Muchowska等人，2019年；Smith和Morowitz，2004年）。这些化合物作为合成聚合物、药品和食品添加剂的平台化学品具有战略重要性（Dai等人，2018年；Liu等人，2017年；Liu等人，2022a年；Sebastian等人，2019年）。随着对可持续化学制造的日益重视，通过rTCA循环进行微生物生产C4-二羧酸已成为石化合成的重要替代方案（Ko等人，2020年）。

酵母（Renduli?等人，2024年；Tran等人，2023年），特别是Yarrowia lipolytica（Cui等人，2023年；Zhong等人，2024a年），由于其优异的耐酸性和强大的遗传工具箱（Liu等人，2025年），以及与低成本生物精炼原料的兼容性（Zhong等人，2024b年），已成为有机酸生物合成的首选工业平台。然而，大多数酵母缺乏天然的rTCA活性，因此需要异源途径的重建。虽然异源表达的rTCA途径在理论上可提供1.12克/克的葡萄糖碳效率，但琥珀酸（SA）——作为1,4-丁二醇、四氢呋喃和聚丁烯琥珀酸等化合物的前体——在工程rTCA系统中存在难以克服的NADH依赖性流量瓶颈（Aliotta等人，2022年；McKinlay等人，2007年）。SA的生物合成需要两个连续的NADH消耗步骤，分别由苹果酸脱氢酶（MDH）和富马酸还原酶（FRD）催化（图1），这超出了糖酵解的再生能力，导致了持续的氧化还原压力。

为了解决细胞质rTCA途径中固有的NADH限制，我们的团队之前在Y. lipolytica中工程化了一种线粒体靶向的rTCA途径。虽然这种区室化策略缓解了细胞质中的NADH短缺，但它无意中引发了与氧化TCA循环的代谢流量竞争，严重限制了SA的产量，仅为0.79克/克葡萄糖（Cui等人，2023年）。利用还原性碳底物的其他方法也证明效果有限。例如，在S. cerevisiae中，工程化了依赖NADH的二羟基丙酮（DHA）途径来代谢甘油以生产SA，尽管如此，所得菌株的产量仍有提升潜力（Renduli?等人，2024年；Xiberras等人，2020年）。同样，在工程化的Issatchenkia orientalis中，甘油-葡萄糖共喂养实现了104.60克/升的SA产量，但产量仍不理想，仅为0.63克/克葡萄糖（Tran等人，2023年）。此外，像甲酸或甲醇这样的高还原性底物会引起宿主严重的毒性，影响生长和生产力（Ahn等人，2017年；Guo等人，2022年；Li等人，2024年）。总体而言，这些策略未能完全解决与SA生物合成相关的持续氧化还原不平衡问题。

鉴于Y. lipolytica中NADPH的丰富储量，这得益于戊糖磷酸途径（PPP）的流量和脂质生成的需求（Masi等人，2021年；Wasylenko等人，2015年），重新利用这一辅因子池成为了一个战略选择。先前的研究表明，过表达PPP酶和依赖NADPH的苹果酸酶可以促进脂质和萜烯的生成，突显了NADPH在Y. lipolytica中的代谢效用（Kang等人，2025年；Liu等人，2024年；Wang等人，2022年）。然而，将NADPH用于SA生物合成遇到了挑战：工程化的NADPH依赖性MDH变体的活性极低（Tomita等人，2006年），尽管异源转氢酶（EcSthA）在天然宿主体内可将SA产量提高18%（Zhu等人，2014年），但在Y. lipolytica中无效，因为辅因子通道不兼容（Cui等人，2023年）。这表明不同物种之间缺乏通用的辅因子解决方案，因此需要开发根本性的新型氧化还原解耦途径架构。

在这项研究中，我们设计了一种非经典的还原性TCA（Nc-rTCA）途径。这种创新性的旁路使用天冬氨酸氨基转移酶（AAT）、天冬氨酸氨裂解酶（AAL）和谷氨酸脱氢酶（GDH）组成的依赖NADPH的模块，替换了氧化还原敏感的草酰乙酸到富马酸的部分（图1）。与之前的辅因子工程方法不同，这种修改有效地规避了氧化还原限制，防止了代谢流量的损失，并显著提高了工程菌株中的SA合成产量。配备Nc-rTCA途径的工程菌株Ncr12在5升生物反应器中实现了98.16克/升的SA产量和0.91克/克的葡萄糖产率（表S1）。该平台在原料利用方面的灵活性通过从木质纤维素水解物和甘油中高产SA得到证明。Nc-rTCA途径成功克服了长期存在的氧化还原障碍，建立了一条可扩展的生物基SA及其高价值衍生物的生产路线。

章节片段

微生物和材料

本研究使用Y. lipolytica的野生型菌株Po1f作为遗传改造的亲本菌株。本研究中使用的菌株列在补充表2中。所有酵母菌株均在含有20克/升葡萄糖、20克/升甘油、20克/升蛋白胨和10克/升酵母提取物的YPDG培养基中于30°C培养。对于重组菌株的筛选，根据所使用的选择标记，工程菌株分别在缺乏营养的SD培养基（含有27.4克/升预混SD基础

优化rTCA途径以实现C4-二羧酸生物合成

rTCA途径是C4-二羧酸生物合成中最广泛采用的途径。为了在Y. lipolytica中建立这一途径，我们首先工程化了需要四种关键酶的细胞质rTCA分支：丙酮酸羧化酶（PYC）、MDH、富马酸酶（FUM）和FRD（图2D）。值得注意的是，Y. lipolytica缺乏内源的FRD（Cui等人，2023年），其天然的FUM和MDH主要催化氧化TCA反应，因此对这些酶的异源替代品进行了全面筛选

讨论

依赖具有天然rTCA途径的厌氧细菌的传统SA发酵面临重大挑战：严格的无氧环境、噬菌体敏感性以及有限的耐酸性增加了工艺的复杂性和成本（Oreoluwa Jokodola等人，2022年；Zhu等人，2014年）。相比之下，酵母平台具有显著优势：强大的耐酸性减少了中和剂的需求，简化的下游处理降低了成本（Li等人，2021年），使其成为理想的候选者

结论

本研究建立了一种新的Nc-rTCA途径用于SA生物合成，解决了传统NADH依赖性rTCA循环中固有的氧化还原不平衡问题。通过系统的途径优化和消除主要副产物的积累，我们开发出了产量创纪录的SA生产菌株Ncr12。值得注意的是，在基本CM1培养基中培养时，SA的产量达到了98.16克/升，葡萄糖产率为0.91克/克，显示出工业规模生产的巨大潜力。Nc-rTCA

CRediT作者贡献声明

陶慧琳：撰写——原始草稿、可视化、验证、软件、方法论、调查、形式分析、数据管理、概念化。郝傲梅：形式分析、数据管理。潘晓月：形式分析、数据管理。钟宇涛：形式分析、数据管理。崔志勇：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目管理、方法论、资金获取。齐庆生：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目管理

利益冲突声明

Q.S.Q.、H.L.T.、Z.Y.C.已向中国国家知识产权局提交了关于本研究中工作的专利申请（CN202410013272.9）。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（授权号：U23A20268、22208192）和微生物技术国家重点实验室（SKLMTFCP-2023-03）的资助。

感谢山东大学微生物技术国家重点实验室的分析和测试中心的支持。