《Metabolic Engineering》：Predictive CRISPR-mediated gene downregulation for enhanced production of sustainable aviation fuel precursor in
Pseudomonas putida
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本研究针对CRISPRi技术在代谢工程中面临的两个关键挑战：有效基因靶点的理性识别和多路CRISPRi系统的高效构建。研究人员开发了计算优先工具FluxRETAP与模块化组装方法VAMMPIRE相结合的新策略，用于增强恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)中可持续航空燃料前体异戊二烯醇(isoprenol)的生产。结果表明，FluxRETAP预测的基因敲除靶点中有46.4%显著提高了异戊二烯醇产量，最高滴度达1.5 g/L，显著优于传统直觉式靶点选择方法(15.7%)。VAMMPIRE实现了最多包含五个sgRNA阵列的CRISPRi构建体的精确组装，减少了上下文依赖性，实现了均匀、位置独立的基因下调。该研究为微生物代谢工程提供了一种高效、可预测的菌株优化新范式。
随着生物技术产业的快速发展，利用微生物细胞工厂生产高价值化学品已成为可持续制造的重要方向。其中，异戊二烯醇(isoprenol)作为一种高度通用的分子，在医药、化妆品和工业化学品等领域具有广泛应用，特别是作为喷气燃料1,4-二甲基环辛烷(DMCO)的前体，在可持续航空燃料领域展现出巨大潜力。然而，异戊二烯醇的生物合成效率常常受到宿主生物代谢通路效率和高产量生产能力的限制。
近年来，CRISPR干扰(CRISPRi)技术作为一种强大的基因调控工具，通过使用失活的Cas9(dCas9)蛋白实现基因表达的抑制，而无需对基因组进行永久性修饰，为代谢工程提供了新的可能性。尽管如此，CRISPRi技术的广泛应用仍面临两大挑战：一是如何理性识别有效的基因下调靶点，二是如何高效构建多路CRISPRi系统。传统的靶点选择方法主要依赖直觉式推理和试错策略，耗时耗力且效率有限；而现有的计算方法如最小切割集(cMCS)往往假设基因相互作用是简单的二元开关逻辑，难以捕捉生物网络中复杂的表达梯度、反馈环和非线性相互作用。同时，多基因敲除的实现受到分子克隆方法的严重限制，CRISPRi阵列在克隆过程中容易因重复DNA序列而发生同源重组事件。
为了解决这些挑战，来自美国联合生物能源研究所(JBEI)的Ian S. Yunus、Taek Soon Lee等研究人员在《Metabolic Engineering》上发表了一项创新性研究，他们整合了一种计算优先工具FluxRETAP(通量-反应靶点优先排序)与一种多功能组装方法VAMMPIRE(多路CRISPRi介导下调的多功能组装方法)，系统性地提高了恶臭假单胞菌KT2440中异戊二烯醇的产量。
研究人员首先应用FluxRETAP算法，这是一种基于基因组尺度模型的简单且计算成本较低的方法，利用通量变异性分析(FVA)和反应通量的高斯分布来优先考虑上调或下调的基因。该算法通过确定基因组尺度代谢模型中最终产物反应的最大理论产量(MTY)，模拟不同生产水平(如MTY的10%至100%)，通过FVA找到与每个水平兼容的通量值，并用高斯分布表示这些通量值。通过计算低生产水平(如10%、20%)和高生产水平(如90%、100%)分布之间的重叠区域，重叠较小的反应(表明低和高生产水平之间通量差异大)获得较高分数，成为基因下调的主要候选者。
与此同时，研究团队开发了VAMMPIRE方法，这是一种基于连接子的模块化克隆组装方法，专门用于简化sgRNA阵列的组装。该方法通过两个简化步骤实现：首先将sgRNA寡核苷酸酶切并连接至sgRNA储存质粒，然后使用基于连接子的模块化克隆方法将sgRNA(s)酶切并连接至CRISPRi质粒。该方法采用组成型J23119启动子控制每个sgRNA的转录，并使用在恶臭假单胞菌KT2440中有功能但在大肠杆菌中无活性的PnagAa启动子驱动dCas9表达，从而最大限度地减少克隆过程中dCas9的表达负担。
关键技术方法
本研究主要采用了几项关键技术：1) FluxRETAP计算平台，基于基因组尺度代谢模型和通量变异性分析预测基因下调靶点；2) VAMMPIRE组装方法，用于构建多路CRISPRi-sgRNA质粒；3) CRISPRi基因下调技术，在恶臭假单胞菌KT2440中实现特异性基因表达抑制；4) 蛋白质组学分析，通过液相色谱-质谱联用技术评估基因下调效率；5) 代谢物分析，监测TCA循环关键中间产物浓度变化。研究使用的恶臭假单胞菌KT2440菌株来自实验室保藏菌种。
3.1. 识别用于提高异戊二烯醇产量的CRISPRi下调靶基因
研究人员选择了一个经过高度工程化、具有高基线滴度的异戊二烯醇生产恶臭假单胞菌KT2440菌株作为全基因组筛选的平台。基于异戊二烯醇生物合成途径中乙酰辅酶A、NADPH和ATP的关键作用，他们首先直觉性地选择了51个参与乙酰辅酶A、辅因子和能量代谢的基因作为下调靶点。与此同时，应用FluxRETAP识别了57个基因作为下调靶点，这些基因主要涉及氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢、碳水化合物代谢、ABC转运代谢、能量代谢、核苷酸代谢和脂质代谢等途径。FluxRETAP根据重叠面积的倒数值对这些基因进行排名，为后续实验验证提供了优先顺序。
3.2. VAMMPIRE：多路CRISPRi介导下调的多功能组装方法
VAMMPIRE方法的开发极大地简化了多路sgRNA质粒的构建过程。研究人员通过该方法成功构建了275个CRISPRi质粒，包括197个携带单个sgRNA的质粒、41个携带两个sgRNA的质粒、24个携带三个sgRNA的质粒、11个携带四个sgRNA的质粒和两个携带五个sgRNA的质粒。所有质粒均通过一锅法组装完成，PCR和Sanger测序验证显示100%的组装准确性。功能验证实验表明，CRISPRi系统在恶臭假单胞菌KT2440中能有效下调红色荧光蛋白(RFP)和必需基因accA(编码乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶亚基α)的表达。蛋白质组学分析进一步证实，125个携带不同sgRNA的样本中，68个基因被下调至少50%，其中51个基因被下调超过95%，证明了CRISPRi在该宿主中的可靠性。
特别值得注意的是，研究人员系统评估了sgRNA在多重阵列中的位置效应。与传统的多顺反子设计不同，VAMMPIRE构建的阵列由独立转录的sgRNA组成，每个sgRNA在相同的调控控制下。实验结果表明，无论sgRNA在阵列中的位置如何，基因抑制水平都保持一致，表明该方法有效减少了位置依赖性，为代谢工程中的可预测基因调控提供了重要优势。
3.3. 预测性CRISPRi下调改善异戊二烯醇生产
为了比较FluxRETAP和直觉式基因选择在提高异戊二烯醇产量方面的效果，研究人员将CRISPRi质粒转化到高产异戊二烯醇菌株(IY1452)中。结果显示，FluxRETAP推荐的基因下调菌株的平均异戊二烯醇滴度显著高于对照组，且显著高于直觉式方法获得的滴度。具体而言，FluxRETAP鉴定的56个基因中，46.4%的基因下调导致异戊二烯醇滴度显著高于对照菌株，而直觉式靶基因选择仅有15.7%的基因表现出更高的滴度。最高的异戊二烯醇滴度达到1469 mg/L，是通过下调FluxRETAP鉴定的PP_4188(编码α-酮戊二酸脱氢酶)实现的，而直觉式组的最高滴度仅为958 mg/L，来自PP_0168下调菌株。这些结果充分证明了FluxRETAP在识别能改善生物生产性能的下调靶点方面的有效性。
3.4. PP_4188下调的代谢和蛋白质组学洞察
对高产菌株PP_4188的深入分析揭示了其高产机制。蛋白质组学分析表明PP_4188被下调了75%，导致细胞内α-酮戊二酸积累增加。进一步的蛋白质组学分析发现，PP_4188下调引起了广泛的蛋白质组变化：约145个基因被下调，193个基因被上调。其中，转谷氨酰胺酶样超家族结构域蛋白(PP_2686)的表达增加了450倍以上。Pearson相关分析显示，PP_2686的上调与高异戊二烯醇滴度呈正相关(相关系数=0.4593，p值=3×10-8)，表明这一现象不是孤立事件。研究人员推测，谷氨酸在异戊二烯醇代谢中扮演重要角色，这与先前观察到的谷氨酸补充能减少恶臭假单胞菌中异戊二烯醇分解代谢的结果一致。
研究人员还尝试通过多基因下调进一步优化产量，将PP_4188与之前鉴定的有潜力的靶点配对进行多重CRISPRi下调。然而，没有一种工程菌株的异戊二烯醇滴度超过单独下调PP_4188的菌株。进一步分析发现，PP_4188单一下调菌株中核糖体亚基编码基因的表达水平降低，这可能触发了细胞应激反应或将资源从核糖体生物合成转移出去。由于核糖体生物合成对蛋白质合成和细胞生长至关重要，其下调可能限制细胞支持额外代谢负担的能力，从而解释了多重基因下调未能进一步提高产量的原因。
研究结论与意义
本研究通过整合预测性建模与模块化CRISPRi工具，成功开发了一种提高恶臭假单胞菌中异戊二烯醇产量的综合策略。FluxRETAP有效优先考虑了能增强异戊二烯醇生产的基因敲除靶点，而VAMMPIRE则实现了CRISPRi构建体的简便、准确且位置独立的组装。观察到的guide RNA位置对基因抑制影响极小这一发现，扩展了CRISPRi阵列在多路应用中的实用性。
该研究的创新性体现在多个方面：首先，FluxRETAP计算方法的成功应用证明计算引导的基因选择能显著提高代谢工程效率，发现的非直观基因靶点对产品产量有重大影响；其次，VAMMPIRE方法解决了多路基因下调构建中的关键技术瓶颈，为合成生物学提供了强大工具；再者，对sgRNA位置效应的系统评估为CRISPRi技术的可靠应用提供了重要见解。
尽管在多重基因下调方面遇到挑战，但本研究揭示的代谢复杂性为未来优化策略指明了方向。例如，精细调控PP_4188的下调水平可能有助于优化代谢通量，减少对核糖体生物合成和细胞适应性的意外干扰，使得实施多个精心校准的基因下调成为可能。
总之，这项研究展示了一种将计算预测与实验验证相结合的系统性方法，为微生物代谢工程提供了新范式。预测性建模与位置稳健的基因敲除相结合，为更高效的设计-构建-测试-学习(DBTL)循环和理性设计高性能微生物细胞工厂铺平了道路，对可持续生物制造和绿色生物经济发展具有重要意义。
