《Metabolic Engineering》：Biosynthetic platform for orsellinic acid-derived meroterpenoids in
Escherichia coli
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本研究针对苔色酸(OSA)来源的聚酮-萜类化合物植物提取效率低、供应不稳定的问题，通过在大肠杆菌中构建从头生物合成平台，结合CRISPRi基因敲降、代谢工程及培养条件优化，将OSA产量提升至202 mg/L，并首次实现grifolic acid (GFA)的微生物合成，为药理活性分子的可持续生产提供了新策略。
在天然产物药物开发领域，苔色酸(Orsellinic Acid, OSA)来源的聚酮-萜类化合物(Meroterpenoids)因其广泛的药理活性（如抗癌、抗HIV、抗糖尿病和抗炎等）而备受关注。然而，这类化合物目前主要从杜鹃花属植物中直接提取，其生产严重受限于植物生长周期长、环境依赖性高、提取工艺复杂以及野生资源保护等问题。更棘手的是，现有微生物发酵法生产OSA的效率极低（最高仅约5 mg/L），严重阻碍了其衍生药物的规模化开发。因此，开发高效、可持续的微生物合成平台迫在眉睫。
为突破这一瓶颈，日本神户大学的研究团队在《Metabolic Engineering》上发表论文，报道了在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功构建的OSA及其衍生聚酮-萜类化合物的从头生物合成平台。研究人员首先通过系统筛选，发现植物来源的III型聚酮合酶(PKS) ORS与其环化酶OAC的共表达，能在大肠杆菌中实现OSA的微量合成（1.4 mg/L）。随后，他们利用CRISPR干扰(CRISPRi)技术对竞争代谢路径进行精准调控，发现敲降脂肪酸代谢调控因子fadR基因可显著提升OSA产量（提高约7.9倍）。代谢组学分析进一步揭示，丙二酰辅酶A(malonyl-CoA)的供应不足是限制OSA合成的关键瓶颈。基于这一发现，研究团队通过过表达乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、泛酸激酶(CoaA)和ATP柠檬酸裂解酶(ACL)，协同强化乙酰辅酶A(acetyl-CoA)和malonyl-CoA的供应，使OSA产量大幅提升至78.6 mg/L。最后，通过优化培养条件（TB培养基、0.2 mM IPTG诱导、20°C培养），OSA产量最终达到202 mg/L，较初始水平提高145倍，并首次在该平台中实现代表性聚酮-萜类化合物grifolic acid (GFA)的从头合成（产量2.5 μg/g-DCW）。
本研究采用的关键技术方法包括：基因工程菌株构建（引入异源PKS及环化酶基因）、CRISPRi介导的基因表达调控、代谢组学分析（监测中心代谢物动态变化）、实时定量PCR验证基因敲降效率，以及高效色谱-质谱联用技术（GC-MS/LC-MS/MS）定量目标产物。
3.1. OSA production in E. coli
通过比较多种I型与III型PKS在大肠杆菌中的表达效果，发现仅当共表达植物来源的ORS与OAC基因，并在25°C低温培养时，才能检测到OSA合成（1.4 mg/L），证明III型PKS更适合在大肠杆菌中表达，且低温有助于酶的正确折叠。
3.2. CRISPR interference for enhancing OSA production via gene expression repression
利用CRISPRi分别敲降poxB-pta（乙酸合成路径）、pabA（芳香族氨基酸合成）和fadR（脂肪酸代谢调控因子），发现fadR敲降对OSA产量提升最为显著（15.1 mg/L），说明抑制脂肪酸合成可有效将malonyl-CoA导向OSA合成路径。
3.3. Rate-limiting step identification using metabolome analysis
代谢组学分析显示，工程菌株中malonyl-CoA浓度极低（<0.03 nmol/mg-DCW），且其在诱导后24小时内几乎耗尽，而acetyl-CoA和柠檬酸储量丰富，明确malonyl-CoA供应是限速步骤。
3.4. Metabolic engineering based on metabolome analysis
通过组合过表达ACC（催化acetyl-CoA向malonyl-CoA转化）、CoaA（增强辅酶A供应）和ACL（利用柠檬酸再生acetyl-CoA），实现acetyl-CoA和malonyl-CoA供应的协同强化，使OSA产量提升至78.6 mg/L。
3.5. Culture condition optimization
系统优化培养基（TB优于2×YT）、碳源（葡萄糖优于甘油）、IPTG浓度（0.2 mM最佳）和培养温度（20°C时单位细胞产量最高），最终在72小时使OSA产量达到202 mg/L，产量为6.1 mg/g-glucose。
3.6. GFA production by optimized OSA high-producing strains
在高效合成OSA的菌株中引入植物来源的异戊烯基转移酶RdPT1，成功实现GFA的细胞内合成（2.5 μg/g-DCW），首次在大肠杆菌中完成OSA来源聚酮-萜类化合物的从头生物合成。
4. Discussion
本研究通过多维度代谢工程策略，将大肠杆菌转化为OSA及其衍生物的高效合成平台。fadR敲降与ACC/CoaA/ACL过表达的协同作用，有效解决了malonyl-CoA供应瓶颈；低温培养优化了III型PKS的活性。尽管GFA产量仍较低（受限于FPP供应和异源酶活性），该平台为其他OSA衍生药物（如daurichromenic acid等）的微生物法生产奠定了基础。未来可通过优化甲羟戊酸路径增强FPP供应、开发细菌兼容性异戊烯基转移酶，并结合实验设计(DoE)进一步优化培养条件，有望实现OSA来源药物的产业化应用。
