《Journal of Hazardous Materials》：From Association to Mechanism: Prenatal PFAS Co-Exposures Induces Fetal Neural Tube Defects via Autophagy-Mediated Ferroptosis
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神经管缺陷与PFAS暴露关联及铁死亡/自噬机制研究。病例对照显示胎盘PFAS（PFOS、PFDA、PFHxS）浓度升高与NTDs显著相关（OR=14.13）。动物实验证实PFAS混合物导致小鼠神经管缺陷，机制涉及铁死亡和自噬通路紊乱，细胞实验验证PFAS抑制GPX4并增加脂质过氧化，铁死亡抑制剂和自噬抑制剂可逆转效应。
陈永妍|程倩慧|杨晨|李赛楠|林海|刘菊芬|金雷|李志文|任爱国|王琳琳
中国北京北京大学健康科学中心公共卫生学院流行病学与生物统计学系，国家卫生健康委员会生殖与儿童健康研究所生殖健康重点实验室
摘要
神经管缺陷（NTDs）是一种严重的先天性畸形，其环境决定因素尚未完全明了。全氟和多氟烷基物质（PFAS）是一种持久性的环境污染物，能够在关键发育窗口期穿过胎盘屏障，与多种不良出生结果有关，但它们与NTDs的关联仍不清楚。我们结合了基于人群的研究、动物实验和细胞实验方法来建立这种关联并探索相关机制。在一项包含271例NTDs病例和391例对照组的病例对照研究中，发现胎盘中的PFAS浓度显著升高（41.29 ng/g vs 22.36 ng/g，P<0.001）。高暴露量与NTDs风险显著增加相关（OR=14.13，95% CI: 4.39–45.49）。三种混合模型方法（BKMR、WQS、Qgcomp）一致认为PFOS、PFDA和PFHxS是主要致病因素，其贡献权重分别为35%、14%和12%。为了验证因果关系，我们将怀孕的小鼠暴露于这种与人类相关的PFAS混合物中，高剂量组出现了NTDs表型（16.18% vs 2.67%），同时伴有胚胎铁积累、氧化应激以及铁死亡和自噬途径的失调，表明这些途径介导了PFAS的发育毒性。在人类多能干细胞（hPSCs）中的机制验证证实，PFAS暴露降低了细胞活力并抑制了GPX4的表达，同时增加了脂质过氧化。重要的是，药理学干预显示出了不同的保护机制：Ferrostatin-1恢复了GPX4/SLC7A11的表达并减少了脂质过氧化，而氯喹阻断了LC3B的激活，防止了NCOA4介导的铁蛋白降解，并减轻了铁的释放，表明PFAS诱导的铁死亡是通过自噬介导的机制，其中过度的自噬促进了铁蛋白吞噬和随后的细胞死亡。本研究确定PFOS、PFDA和PFHxS为潜在的发育毒性物质，并指出铁死亡和自噬可能是潜在的治疗靶点，提示需要进一步评估PFAS的调控以保护孕产妇健康。
引言
神经管缺陷（NTDs）是由于胚胎神经管闭合失败而导致的严重先天性畸形（例如无脑畸形、脊柱裂）。尽管全球患病率为0.05-0.2%，但在某些中国地区的发病率仍显著高于发达国家[1]。传统的监测系统排除了早期诊断和终止的病例，大大低估了实际负担。基于人群的研究显示，在高风险中国地区的实际发病率高达每10,000人中有31.5例，远超全国平均水平[2]、[3]、[4]、[5]。NTDs带来了巨大的疾病负担和经济成本[1]，因此对其病因学的研究对于公共卫生至关重要。NTDs的病因涉及复杂的基因-环境相互作用[6]、[7]。由于NTDs常导致胎儿死亡或严重的终身残疾，高外显率的致病基因变异不太可能有效传递给后代，这表明病例主要由环境致畸因素在易感遗传背景下的作用引起。环境因素可以在关键发育窗口期诱导新生突变或表观遗传失调[8]、[9]，因此是预防的关键且可改变的目标。虽然母体叶酸缺乏是一个公认的风险因素，围孕期补充叶酸可以有效降低NTDs的发病率[8]、[9]、[10]、[11]，但即使在全国范围内实施了强化政策，仍有约30%的病例无法预防[12]。此外，目前确定的环境风险因素仅占NTDs风险的28–44%[13]、[14]、[15]，这意味着仍有大量病例无法解释，提示存在其他尚未充分描述的环境危害。
在这种情况下，阐明持续高NTDs发病率地区的特定环境暴露因素尤为重要。全氟和多氟烷基物质（PFAS）是一类具有生物累积潜力和毒性的高度持久性合成化学物质，因此成为环境健康研究的主要焦点。PFAS广泛应用于工业生产和消费品[16]，在全球人群中普遍检测到[17]，包括孕妇[18]，通过饮食、饮用水和空气等多种暴露途径[19]、[20]。中国作为主要生产国，其环境介质和人体生物监测样本中的PFAS污染水平显著较高[21]、[22]、[23]，并且PFAS能够有效穿过胎盘屏障，直接暴露发育中的胚胎[24]。我们的研究区域以煤炭开采和化工制造业为主，农业依赖受污染的灌溉水，且存在持久性有机污染物的环境负担[25]、[26]、[27]。该地区也被确定为PFAS影响区域，监测研究显示汾河流域和太原市的乳制品中存在遗留和新兴PFAS，反映了当地人群广泛的环境和饮食暴露[28]、[29]。综上所述，这些观察结果表明，像PFAS这样的持久性生物累积化学物质可能导致了这一脆弱人群中叶酸反应不佳的NTDs负担，需要进行系统研究。
有令人信服的证据表明，PFAS具有内分泌干扰、生殖和发育毒性[30]、[31]、[32]：流行病学研究将孕前PFAS暴露与低出生体重、胎儿生长受限、早产和先天性心脏病联系起来[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]，而动物和细胞实验表明PFAS（如PFOA、PFOS）会扰乱女性生殖内分泌并引起胚胎发育异常[37]、[38]、[39]、[40]、[41]。最近的研究越来越多地关注环境污染物的混合效应。PFAS混合物与代谢综合征[42]、甲状腺功能障碍[43]和不良出生结果[44]有关，有证据表明其效应超出单一化合物的毒性。然而，专门研究PFAS暴露——特别是多种PFAS的共同暴露——与NTDs风险的研究仍然不足。鉴于人类暴露涉及复杂的PFAS混合物而非单一化合物，评估它们的综合致畸潜力对于准确的风险评估和公共卫生保护至关重要。
PFAS共同暴露导致神经管畸形的分子机制尚不清楚。最近的研究强调了铁死亡和自噬在神经发育毒性和胚胎发生中的重要作用[45]、[46]。铁死亡和自噬维持细胞稳态，对神经管闭合至关重要[46]、[47]、[48]。这两个过程密切相关；过度的自噬可以通过铁蛋白吞噬触发铁死亡，从而加剧铁过载[49]。多项研究表明，环境污染物通过铁死亡或自噬失调引起神经毒性[50]、[51]。最近的实验研究表明，PFAS（特别是PFOS和PFOA）可以在多个体细胞系统中诱导铁死亡并破坏自噬相关途径，包括肝细胞、肾小管细胞、内皮细胞和卵细胞[52]、[53]、[54]、[55]、[56]。这些效应表现为脂质过氧化、氧化应激、GPX4和NCOA4依赖的铁蛋白吞噬失调。NTDs患者的铁死亡相关分子表达异常[57]、[58]。然而，尚未有研究专门探讨PFAS暴露是否在胚胎神经管形成期间干扰自噬介导的铁死亡过程。基于这些证据，我们假设PFAS暴露可能通过触发自噬介导的铁死亡来诱导NTDs，导致神经管细胞死亡和闭合失败。
我们假设孕前PFAS混合物暴露通过自噬介导的铁死亡机制增加NTDs风险。为了验证这一假设，本研究结合了基于人群的研究、动物模型和细胞实验，具有三个具体目标：1）确定孕前PFAS暴露（单独和联合）与人类人群中NTDs风险之间的关联，并识别主要的PFAS致病因素；2）评估在神经管闭合的关键窗口期暴露于与人类相关的PFAS混合物是否会在小鼠中诱导NTDs表型，并评估相关的自噬和铁死亡途径的变化；3）使用人类多能干细胞阐明自噬介导的铁死亡在PFAS诱导的发育毒性中的机制作用。
病例对照研究
这项基于人群的病例对照研究利用了中国山西省自2002年建立的出生缺陷监测网络，相关现场协议和质量控制程序已在之前的出版物中详细说明[2]、[59]。病例包括通过产前超声或产后检查确诊的NTDs（无脑畸形、脊柱裂、脑膨出）的胎儿/新生儿，涵盖活产、死产和选择性终止的案例。
研究人群特征和PFAS暴露水平
本分析包括271例NTDs病例和391例对照组。研究人群的特征总结在表1中。病例组表现出妊娠周数较短、教育水平较低、出生缺陷史较高、妊娠期间发热率较高以及叶酸补充率较低。其他人口统计特征没有发现统计学上的显著差异。
胎盘分析显示检测率存在显著异质性（34.14%–97.13%）
讨论
这项研究提供了来自流行病学、动物学和细胞学层面的综合发现，表明孕前共同暴露于PFAS与NTDs风险增加有关。在病例对照研究中，较高的胎盘PFAS水平——特别是PFOS、PFDA和PFHxS——与NTDs风险强烈相关，且在多种混合模型中呈现出一致的剂量-反应趋势。
结论
本研究提供了基于人群的证据，表明孕前PFAS混合物暴露显著增加了神经管缺陷的风险，PFOS、PFDA和PFHxS被确定为主要致病因素。通过将人类数据与动物和细胞模型相结合，我们证明了PFAS混合物通过自噬介导的铁死亡途径损害神经管闭合。这些发现对公共卫生和未来研究具有重要意义。首先，它们强调了迫切需要
环境影响
本研究表明，孕前暴露于PFAS混合物显著增加了神经管缺陷的风险，PFOS、PFDA和PFHxS被确定为主要致病因素。来自动物和细胞模型的综合机制证据表明，PFAS化合物通过自噬介导的铁死亡途径引起发育毒性，其特征是铁蛋白吞噬驱动的铁释放、脂质过氧化和GPX4抑制。这些发现突显了
伦理审查
本研究获得了北京大学（中国北京）机构审查委员会的批准，并在数据收集前获得了所有参与者的知情同意。
数据可用性
本研究生成的数据集可在合理要求下由相应作者提供。
资助
本研究得到了国家重点研发计划、中华人民共和国科学技术部（项目编号2022YFC2705205）和中国国家自然科学基金（项目编号82473639）的支持。
作者贡献声明
任爱国：监督、资源提供。
王琳琳：写作 – 审稿与编辑、监督、方法学、资金获取、概念构思。
陈永妍：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、调查、数据分析、概念构思。
程倩慧：调查。
杨晨：调查。
李赛楠：调查。
林海：调查。
刘菊芬：监督、资源提供。
金雷：监督、资源提供。
李志文：监督、资源提供。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来提高语言的清晰度和可读性。使用该工具后，作者根据需要仔细审查和编辑了内容，并对本文的内容负全责。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
