《Journal of Anatomy》：Neural modulation of ocular immunity: Exploring a sympathetic-macrophage neuroimmune link in the human ciliary body
1 引言
次级淋巴结构（如淋巴结和脾脏）的研究揭示了交感神经在免疫调节中的重要作用。在这些结构中，交感神经与免疫细胞毗邻，并可通过肾上腺素能受体信号改变其功能。从这一视角看，免疫系统功能失调（如慢性炎症）可能是神经系统调节异常的结果。这种神经免疫连接的存在并不局限于次级淋巴结构，而在外周组织（如肠道、皮肤和肺）中也日益被认识到。这促使我们推测眼部免疫反应可能同样受到神经控制，而慢性眼部炎症性疾病可能是神经免疫调节受损的结果。若是如此，这些神经或其相应的免疫细胞受体可能代表治疗慢性眼部炎症性疾病（如葡萄膜炎和视网膜炎）的新治疗靶点。
尽管已知结膜和泪管中存在淋巴组织，但眼球本身是一个缺乏免疫力的器官，没有明显的淋巴组织。然而，睫状体（CB）似乎是眼部系统的免疫调节区室；在眼部免疫挑战期间，免疫细胞从血液被募集到CB基质，并直接（即通过睫状小带纤维）或间接（通过房水）迁移到眼部结构，包括晶状体和角膜。因此，CB被认为是可能存在眼部神经免疫连接的位置，这一假设得到了一项研究的支持，该研究显示大鼠睫状突基质中的神经与巨噬细胞紧密靠近。
未能检索到关于人类CB中神经与巨噬细胞之间联系的数据。因此，本研究的主要目的是确定人类睫状突基质内是否存在交感神经，研究这些神经空间相关的巨噬细胞是否存在，以及这些巨噬细胞是否表达β2-肾上腺素能受体（β2-ARs）——已知该受体参与眼部相关促炎过程的激活。结合组织切片的显微镜检查和全标本制备的三维（3D）共聚焦显微镜检查，进行了尸体解剖和免疫组织化学分析。
2 材料与方法
2.1 人体组织收集
研究使用了七只来自成年人体捐赠者（年龄73-93岁）的右侧眼球。眼球摘除后，固定在4%多聚甲醛中48小时。随后移除角膜、晶状体、虹膜和玻璃体，将眼球切成四个象限（每个象限包含部分脉络膜、睫状体和虹膜）。随机选择每个眼球的两个象限用于本研究，小心移除巩膜和视网膜（包括其色素层），得到仅含葡萄膜的薄样本。一个葡萄膜象限用于光学显微镜分析，另一个象限进一步修剪为仅含CB的全标本，用于光片成像分析。另外两个象限储存供未来研究使用。
2.2 光学显微镜的组织样本制备
葡萄膜样本经过乙醇梯度脱水、二甲苯透明和石蜡包埋。每个样本切成两块，包含葡萄膜的所有区域：虹膜、睫状体和脉络膜。每部分分别包埋，使得最终的组织切片包含所有葡萄膜部分并代表初始象限的不同区域。石蜡块用切片机切成20微米厚的切片，贴附在载玻片上，经过脱蜡、复水化和热诱导表位修复（HIER）预处理。切片进行苏木精-伊红（HE）染色以观察一般组织形态学，并进行免疫组织化学染色以显示神经总数、交感神经存在、 putative神经递质释放位点及其与巨噬细胞的接近程度，以及感觉和副交感神经的存在。
2.3 H&E染色
脱蜡复水后的组织切片用苏木精染色10分钟，流水冲洗后，浸入50%乙醇，再用伊红染色1分钟，随后经过梯度酒精脱水、二甲苯透明，最后用Entellan封片。
2.4 用于显示神经总体存在以及感觉和副交感神经存在的单一免疫组织化学染色
使用针对蛋白质基因产物9.5（PGP9.5，也称为泛素羧基末端水解酶，一种神经元胞质蛋白）的抗体检测总体神经存在。使用针对胆碱乙酰转移酶（ChAT，参与副交感神经递质乙酰胆碱合成的酶）的抗体检测副交感神经。使用针对降钙素基因相关肽（CGRP，存在于初级传入神经元中的神经肽）的抗体检测感觉神经。
脱蜡、复水和HIER处理后，切片用5%正常人血清（NHS）封闭10分钟，然后与一抗（兔抗PGP9.5、山羊抗ChAT或小鼠抗CGRP）孵育。随后切片洗涤，并与二抗（Brightvision Poly-AP Goat-anti-Rabbit (PGP9.5)、Brightvision Poly-AP Goat-anti-Mouse (CGRP) 或swine-anti-goat-AP (ChAT)）孵育30分钟。然后切片洗涤，与Liquid Permanent Red (LPR) 孵育10分钟，苏木精复染，脱水透明后封片。人交感干切片作为一般和交感神经标志物的阳性对照，迷走神经切片作为传入和副交感神经标志物的阳性对照，肾上腺用于突触素标志物，淋巴结切片用于巨噬细胞标志物CD68。阴性对照通过CB切片与不含一抗的TBS-3%BSA孵育获得。
2.5 用于交感神经和巨噬细胞，以及神经递质囊泡和巨噬细胞的双重（顺序）免疫组织化学染色
使用针对酪氨酸羟化酶（TH，参与交感神经递质去甲肾上腺素（NE）合成的酶）的抗体检测交感神经。使用针对分化簇68（CD68，一种存在于巨噬细胞膜中的N-和O-糖基化I型整合素蛋白）的抗体检测巨噬细胞。使用针对突触素（一种存在于神经元突触前囊泡中的整合膜糖蛋白）的抗体检测 putative神经递质释放位点。
脱蜡、复水和HIER处理后，用0.3%甲醇过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶20分钟。切片用5% NHS封闭10分钟，然后与一抗混合物（TH/CD68 或 Synaptophysin/CD68）在室温下孵育过夜。随后切片洗涤，与二抗混合物（BrightVision Poly-AP Goat-anti-rabbit 和 Goat-anti-mouse IgG/HRP）孵育30分钟。切片洗涤后，先与LPR孵育10分钟，再与PermaGreen Plus/HRP孵育10分钟。最后切片洗涤，苏木精复染，脱水透明后封片。阴性对照通过用不含一抗的TBS-3%BSA孵育获得。人脾脏切片作为巨噬细胞、交感神经和血管球的阳性对照。
2.6 切片显微镜评估
所有切片使用DM6显微镜通过明场显微镜进行评估。交感神经、巨噬细胞的存在及其相互空间关联通过数字图像分析进行定量分析，而感觉和副交感神经的存在则进行描述性报告。
2.7 巨噬细胞及其与交感神经空间关联的图像分析
使用40倍物镜捕获每个葡萄膜切片的明场拼接图像。将每个图像的TIFF文件加载到Fiji (ImageJ) 软件中。转换为8位类型，颜色反转，并设置阈值以选择切片的所有可见组织。使用"细胞计数器"插件手动计数交感神经的数量、巨噬细胞的数量以及这些结构空间关联的数量。空间关联定义为巨噬细胞在视觉上似乎与神经重叠或接触的情况。然后使用套索工具手动选择CB，并使用"分析颗粒"命令测量以μm2表示的表面积。交感神经和巨噬细胞的数量及其空间关联表示为相对于CB表面积的比率。
2.8 用于3D共聚焦成像的组织样本制备
为了更好地理解交感神经和巨噬细胞的三维关系以及这些巨噬细胞是否表达β2-ARs，使用针对TH、CD68和β2-ARs的抗体对仅含CB的全标本进行免疫组织化学染色。
葡萄膜全标本用dH2O冲洗10分钟，然后用30%、70%甲醇（MeOH）各脱水10分钟，再用100% MeOH脱水两次，每次15分钟。随后样本在二氯甲烷中孵育2小时，再用MeOH洗涤三次，每次至少1小时。在3:1:1的MeOH:DMSO:H2O2混合物中进行漂白脱色素，在灯光下进行4天。通过孵育在30% MeOH的dH2O溶液中，然后用dH2O洗涤三次，每次10分钟，进行复水。接下来，样本在FLASH试剂R2中洗涤。更换试剂后，样本在54°C下孵育过夜。此后，标本在含有0.2% Triton X-100的PBS中洗涤三次，每次30分钟。在封闭缓冲液（补充有0.2% Triton X-100、10% FCS、0.02%叠氮化钠、1% BSA和5% DMSO的PBS）中封闭30分钟。所有抗体用封闭缓冲液稀释。样本先与抗CD68 (1:100) 和抗β2AR (1:100) 一抗孵育过夜，PBS洗涤三次。二抗孵育使用驴抗兔Alexa Fluor 546和山羊抗小鼠Alexa Fluor 680。样本PBS洗涤三次以去除未结合抗体，然后与抗TH抗体孵育过夜。PBS洗涤三次后，使用驴抗兔Alexa Fluor 488和1:1000 HOECHST 3342进行二次检测过夜。样本PBS洗涤三次。最后进行脱水系列（30%、70%、100% MeOH的dH2O溶液，各10分钟，100% MeOH更换三次，每次1小时）。样本通过顺序浸入30%、70%、100%水杨酸甲酯的MeOH溶液中各1小时，然后在100%水杨酸甲酯中孵育三个过夜进行光学清除。
2.9 3D显微镜评估
成像时，样本封固在水杨酸甲酯中，置于两个盖玻片之间。使用Andor BenktOP BC43转盘系统（配备10倍0.45 NA和20倍0.7 NA物镜，尼康），激光激发波长为405、488、561和638 nm进行显微镜检查。另外在倒置Leica TCS SP8共聚焦显微镜（配备405、488、561和633激光器）上进行成像。使用Imaris和LAS X软件分别采集成像数据。使用Imaris Viewer 9.6.0对3D图像投影进行伽马校正，结果以代表性方式呈现。
3 结果
3.1 睫状体的神经支配
苏木精-伊红（HE）染色切片评估显示所有切片均呈现典型的葡萄膜形态，未见明显病理改变。使用一般神经标志物（PGP9.5）染色显示葡萄膜所有区域均有高度神经支配。神经存在于脉络膜、虹膜、睫状体基质和睫状肌中。由于交感神经代表其他器官神经免疫连接中的主要神经，我们使用交感神经标志物（TH）对葡萄膜组织进行了表征。在CB基质，包括睫状突中观察到交感神经。CB交感神经密度在个体内部和个体之间存在差异。大多数交感神经代表离散的基质神经，常显示斑点模式，暗示存在血管球，因此是 putative神经递质释放的局部位点。这些观察结果在所有样本中一致出现，表明这是CB的一个固有特征。为了进一步评估观察到的基质相关交感神经不仅仅是"路过"，而是确实参与局部神经递质释放，对所有样本进行了突触素存在评估。所有CB样本均含有突触素免疫反应性神经，其数量和分布与交感神经高度重叠。为了进一步验证突触素标志物主要与交感神经相关，对相邻切片进行了感觉和副交感神经染色。使用标志物CGRP和ChAT分别观察到感觉和副交感神经，但它们的数量明显低于交感神经，证实大多数突触素免疫反应来自交感神经。由于感觉和副交感神经不是本研究重点，未进行进一步量化。
3.2 巨噬细胞存在于睫状体中，其中一个亚群与交感神经空间相关
为了检查巨噬细胞是否存在于人类CB中，我们最初用巨噬细胞标志物（CD68）染色葡萄膜切片。在所有CB中一致检测到巨噬细胞，均匀分布在脉络膜毛细血管层和睫状突之间。它们在CB中的出现呈现随机模式。由于在所有切片中都发现了巨噬细胞，它们很可能代表常驻实体。每个个体的两个切片之间巨噬细胞数量的变异性较低，但个体之间观察到相当大的变异性。
为了进一步评估这些常驻巨噬细胞是否与交感神经空间相关，对葡萄膜切片进行了TH和CD68的双重顺序染色。图像显示所有CB中均有巨噬细胞与TH阳性区域空间相关。个体内部和个体之间的接近程度存在高度变异性。
使用3D共聚焦显微镜来更好地理解这种潜在的三维交感神经-巨噬细胞神经免疫连接。所有研究对象的CB基质均有密集的交感神经支配。在睫状突中，这些神经分布更随机，而在扁平部，神经更平行走向。进一步仔细观察发现，这些巨噬细胞中有相当数量与这些神经空间相关，特别是在扁平部，这些巨噬细胞似乎与神经纵向排列，甚至常常位于神经之上（共定位）。CB中的大多数巨噬细胞表达清晰可见的β2-ARs。
3.3 其他观察结果
所有葡萄膜切片都包含部分脉络膜，虽然这不是本研究重点，但对脉络膜中交感神经和巨噬细胞的存在进行了定性检查。一致观察到脉络膜毛细血管层中有巨噬细胞与交感神经空间相关。虹膜中没有明显可见的巨噬细胞，但在虹膜色素上皮层正下方观察到交感神经。脉络膜和虹膜均含有突触素免疫反应神经，其模式与交感神经血管球高度重叠。还经常观察到交感神经与黑素细胞和基质细胞（后者很可能代表（肌）成纤维细胞）空间相关。
4 讨论
本研究表明，人类睫状突基质主要包含交感神经，并且大量表达β2-AR的巨噬细胞与这些神经空间相关。此外，这些巨噬细胞在所有样本中似乎与这些神经纵向排列并直接位于其上。因此，我们首次为人类潜在的眼部神经免疫连接提供了形态学证据。虽然显微镜观察显示只有一部分巨噬细胞紧靠交感神经，暗示可能存在短期突触连接，但必须注意功能性神经免疫连接不一定局限于固定位置的静态关系。巨噬细胞表现出迁移行为，神经递质可以扩散一定距离，这种现象称为容积传输；即神经递质不释放到突触间隙，而是排入细胞外基质，通过扩散到达其效应细胞。
实验研究表明，在眼部免疫挑战期间，免疫细胞（包括巨噬细胞）从血液被募集到CB基质，然后它们直接（例如通过睫状小带纤维）或间接（通过房水）迁移到眼部结构，包括晶状体和角膜。在这种迁移过程中，免疫细胞穿过睫状突基质，我们假设在这里，免疫细胞通过β2-ARs信号接收来自交感神经的局部免疫调节指令。
通常，局部释放的NE激活β2-ARs可通过触发巨噬细胞分化为M2抗炎巨噬细胞亚型，直接影响巨噬细胞极化和细胞因子信号传导。因此，睫状体基质中的交感神经活动可能具有抗炎作用，而慢性特发性葡萄膜炎和其他（神经）免疫性眼病可能是（局部）反射性交感神经活动低下的结果。在这种情况下，（局部）激活这些交感神经，例如通过电刺激，或使用β2-AR激动剂可能使患者受益。
然而，在查阅文献以进一步支持交感神经系统对眼部炎症的抗炎作用时，相反的效果似乎更常见。在一项关于角膜伤口愈合的实验研究中，通过对动物施加束缚应激来操纵自主神经系统活动，交感神经活动增加，炎症水平也随之增加。此外，关于慢性应激与葡萄膜炎关系的临床研究显示，应激（因此交感神经活动增加）与葡萄膜炎的发作和加重呈正相关。如何解释交感神经系统的这种相反效应？交感神经可以以情境依赖的方式负向或正向调节炎症反应。一种解释是慢性应激导致免疫细胞持续暴露于高水平的NE。正如在哮喘患者中所显示的那样，这可能导致β2-AR基因表达减少，从而对NE的抗炎特性敏感性降低。随着β2-ARs数量减少，NE可能 then 与低亲和力的α肾上腺素能受体结合，后者已知在巨噬细胞中表现出促炎作用。
为了进一步探索CB相关交感神经或巨噬细胞上的β2ARs是否可以作为炎症性眼病治疗的潜在免疫调节治疗靶点，应进一步了解这些神经和ARs在不同条件下在局部免疫调节中的作用。由于我们的发现与大鼠先前的解剖学发现相似，啮齿动物可能代表一个合适的实验模型来研究上述问题。可以实验诱导神经炎性眼病，并研究交感神经（例如通过电刺激或去神经支配）对常驻巨噬细胞的影响。研究应涵盖多种条件，如慢性应激，同时检查肾上腺素能受体表达谱。
有趣的是，在多种组织（包括皮肤、肠道、脂肪组织）中观察到一群巨噬细胞亚群，称为神经元相关巨噬细胞（NAMs），并与多种神经类型（包括交感神经）相关联。虽然尚未完全阐明，但有人认为在这些组织中，NAMs除了免疫监视外，还为神经稳态提供必要信号，并可能参与NE清除（它们吸收过量的NE并限制邻近细胞中儿茶酚胺诱导的过程）和神经再生。巨噬细胞也可能主动与交感神经元相互作用。已知它们分泌Slit3，一种细胞因子，可以增加交感神经活性。因此，除了协调免疫反应外，还应考虑本研究中观察到的与交感神经空间相关的巨噬细胞的其他作用。
虽然本研究侧重于交感神经与巨噬细胞的接近程度，但葡萄膜含有各种其他参与局部免疫的免疫细胞。由于许多免疫细胞，包括树突状细胞和T细胞，表达ARs，它们可能也受交感神经控制，应纳入未来研究。
与先前研究一致，我们还观察到交感神经（至少在CB和脉络膜中）与基质细胞接近，后者代表非血管平滑肌细胞，也称为肌成纤维细胞。有趣的是，这些葡萄膜肌成纤维细胞已被证明形成网状板层，类似于淋巴结和脾脏的网状纤维网络。在淋巴器官中，网状纤维网络形成支架，引导免疫细胞迁移，这一过程在脾脏和淋巴结中可由交感神经调节。此外，这些肌成纤维细胞可以调节免疫细胞的分化和功能。如果在CB中，肌成纤维细胞在免疫细胞迁移和功能的调节中发挥类似作用，它们可能在CB炎症反应的神经免疫调节中发挥间接作用，因此也应纳入未来研究。
总之，人类CB基质是一个主要受交感神经支配的组织，显示出与其他淋巴组织的几个相似之处。除了其常见的生理功能外，这些交感神经可能参与调节葡萄膜和一般眼部免疫反应。未来对人体组织的研究应旨在用不同年龄组、性别和医疗背景的研究对象补充当前发现，并包括其他免疫细胞和中间结构，如肌成纤维细胞。此外，啮齿动物的实验研究可以为机制细节提供有价值的见解。
5 局限性
研究对象的年龄较大可能影响了结果，因为存在未知医疗状况影响葡萄膜免疫和神经组成的可能性增加。因此，本研究构成了增加人类眼部组织知识的探索性方法。用更大、年龄多样的样本以及具有已知病史的个体样本补充当前数据可以进一步推动研究工作，并允许对发现进行统计分析。最后，脉络膜上的色素难以完全去除，因此一些残留色素可能在一定程度上阻碍了免疫组织化学标志物的可见性。未来的研究可能受益于在免疫组织化学程序前对样本进行漂白以去除残留色素。
作者贡献
Cindy G. J. Cleypool 和 Tanya S. Karakyriakou 设计了研究，进行了数据采集和分析，设计了图表，并撰写了手稿。Claire Mackaaij, Mark van Zijverden, 和 Hendrik A. Messal 执行了技术程序和数据采集，并帮助撰写了手稿。Jeannette Ossewaarde-van Norel 和 Ronald L. A. W. Bleys 帮助修改了手稿。Cindy G. J. Cleypool 监督了项目。
致谢
我们感谢 Jonas J.W. Kuiper 博士在手稿撰写过程中提出的建设性建议。
利益冲突声明
所有作者均无利益冲突。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。由于隐私或伦理限制，数据未公开可用。
