《Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology》：Tagging Very Small Fish: Two Effective and Low Impact Methods
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本文系统评述了针对非洲慈鲷（Astatotilapia burtoni）幼鱼开发的两种微型标记技术：纹身墨水注射法和鱼线穿刺法。通过纳米注射器（Nanoject II）实现100 nL级墨水精准注射，并采用鱼线穿刺技术实现长期个体追踪。研究证实两种方法均不影响幼鱼麻醉恢复（MS-222）和开放场探索行为，为发育生物学（Developmental Biology）和社会神经科学（Social Neuroscience）研究提供了关键技术支撑。
摘要
个体识别是行为生态学和发育生物学研究的基石。本研究针对体长仅8.31±0.039 mm的非洲慈鲷幼鱼，开发了两种微型标记方案。纹身注射法采用玻璃毛细管针头注入100 nL级 tattoo ink，标记可持续2.5-4周；鱼线穿刺法使用0.051 mm直径的贝克利纳米鱼线（Berkley NanoFil）制作彩色标牌，有效期达数月。通过麻醉恢复实验和开放场测试（Open Field Test），证实两种技术对幼鱼生理和行为无显著影响。
1 引言
现有标记技术如可见植入弹性体（Visible Implant Elastomer）和被动集成应答器（PIT）均不适用于毫米级幼鱼。本研究通过改进传统方法，首次实现了对口腔孵化后1日龄幼鱼（标准体长4.6-10.18 mm）的个体识别。图1展示了不同体型对应的标记方法选择策略，其中直径0.1 mm的昆虫针（minutien pin）专为最幼小个体设计。
2 方法
2.1 实验动物
采用实验室培育的非洲慈鲷种群，幼鱼取自亲鱼口腔孵化后10-13天的仔鱼。所有操作遵循美国国立卫生研究院（NIH）实验动物护理指南。
2.2 纹身标记技术
2.2.1 注射系统构建
使用千年妈妈纹身墨水（Millennium Mom's Tattoo Ink）与保持剂（Keep It Wet）按1:1-1:4比例稀释。通过微管拉制仪（PUL-1）制备毛细针头，配合纳米注射器（Nanoject II）实现50.6 nL×2的精准注射（图2A）。
2.2.2 操作要点
麻醉后的幼鱼置于浸水纸巾上，针头以垂直于脊柱方向刺入背肌。注射后留针5秒防止墨水反流，每次更换针头前用乙醇擦拭（图2B-E）。
2.2.3 麻醉恢复监测
记录停止运动（52.5±3.0 s）、丧失平衡（30.6±2.9 s）等麻醉指标。复苏阶段采用人工鳃部通气，直至恢复自主游泳（407.3±51 s）。数据显示标记组与对照组恢复指标无显著差异（表1）。
2.3 鱼线穿刺标记
2.3.1 标签制备
使用2磅拉力（0.051 mm）鱼线配合31G胰岛素针头。通过锐器针头分离技术（图4D-E），将预染色鱼线穿入背肌后打结形成环形或杠铃状标签。超胶（super glue）固定可延长颜色保持至8周。
2.3.2 行为学验证
对标记后20小时的幼鱼进行开放场测试（图5A），结果显示标记组与对照组在各区域停留时间（F(1.46,13.13)=13.44, p=0.001）和进入频率无统计学差异，但调查区（investigate zone）探索活动显著减少。
3 结果
3.1 麻醉恢复
纹身标记组在停止通气时间（54.1±3.5 s）显著长于对照组（p=0.039），但整体恢复进程未受影响。独立通气时间（107.9±18 s）与身体运动恢复高度相关（r2=0.72）（表2）。
3.2 行为学表现
鱼线标记组在开放场中表现出与对照组相似的空间利用模式，仅调查区探索时间显著减少（p<0.0001），表明标签对基础运动功能无影响。
4 讨论
4.1 纹身技术优势与局限
深色墨水（如蓝色）标记可持续4周，但黄色等浅色系消退较快。墨水颗粒在肌肉组织中的滞留机制不同于真皮注射，导致标记非永久性。未来需验证颜色对社会行为的影响。
4.2 鱼线标记的适应性
98%的术后存活率证实该技术安全性。标签重量（0.0005 g）与幼鱼体重（0.022 g）比为2.3%，未引起显著行为异常。建议根据实验周期选择颜色固定方案。
5 结论
两种标记技术突破了毫米级脊椎动物个体识别的技术瓶颈，为早期发育研究（Early-life Development）和纵向追踪（Longitudinal Tracking）提供了关键方法学支持。该方法体系可推广至其他小型模式生物的研究领域。
