《Stem Cell Reports》：Derivation and analysis of human somatic sensory neuron subtypes facilitated through fluorescent hPSC reporters
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外周感觉神经病变（PSN）缺乏有效治疗策略，部分源于缺乏可模拟人类感觉神经元异质性的模型。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在人多能干细胞（hPSC）中构建了AVIL、NTRK1、MAFA和RUNX3荧光报告系统，分别标记全部体感神经元、伤害性/温度感受器、低阈值机械感受器和本体感受器。这些工具突破了现有分化协议效率低、亚型选择性差的瓶颈，为PSN疾病建模和药物筛选提供了关键资源。
人类感觉神经系统通过复杂的神经元网络传递疼痛、触觉和本体感觉等信号，其功能障碍导致的外周感觉神经病变（Peripheral Sensory Neuropathy, PSN）严重影响患者生活质量。然而，针对PSN的治疗策略开发长期受阻，部分原因在于缺乏能够精准模拟人类感觉神经元异质性的人类模型。现有的人多能干细胞（human Pluripotent Stem Cell, hPSC）分化协议虽能生成感觉神经元，但存在效率低、亚型混杂且缺乏特异性标记等问题。为突破这一瓶颈，哥伦比亚大学研究团队在《Stem Cell Reports》上发表研究，开发了一套荧光报告hPSC工具集，实现了对特定感觉神经元亚型的实时追踪和分离，为疾病机制研究和药物开发提供了革新性平台。
研究团队通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在hPSC中构建了四种荧光报告系统：AVIL:tdTomato（标记全部体感神经元）、NTRK1:tdTomato（标记伤害性/温度感受器）、MAFA:tdTomato（标记低阈值机械感受器）和RUNX3:tdTomato（标记本体感受器）。这些报告基因通过P2A或Cre/loxP系统与内源基因表达耦合，确保荧光信号准确反映目标神经元亚类的分化状态。研究采用改良的胚胎体（Embryoid Body, EB）分化协议，通过时序添加BMP4、视黄酸（Retinoic Acid, RA）及神经因子（如NGF、BDNF等）模拟体内感觉神经发育轨迹。
关键实验方法概述
研究以RUES2人胚胎干细胞（hESC）为主要模型，通过胚胎体分化和神经营养因子诱导驱动神经嵴分化。利用免疫荧光染色、全细胞膜片钳记录、钙成像和流式细胞分选（FACS）验证神经元功能特性；转录组分析（RNA-seq）评估分子特征；基因编辑通过gRNA/Cas9质粒电转实现，脱靶效应经测序排除。
结果分析
1. 通用感觉神经元报告系统AVIL:tdT的构建与验证
研究团队首先针对ADVILLIN（AVIL）基因设计报告系统，该基因在人类背根神经节（Dorsal Root Ganglion, DRG）中特异性表达。分化至第30天（DIV30）时，约24.5%的神经元表达tdTomato（tdT），且几乎所有tdT+神经元共表达感觉神经元标志物BRN3A和ISLET。电生理记录显示，这些神经元具备动作电位和重复放电能力，证实其功能成熟性。
2. NTRK1:tdT报告系统标记伤害性感受器
NTRK1（编码TRKA蛋白）是伤害性感受器的关键标志。分化早期（DIV20）tdT+神经元占比达35.4%，但随培养时间延长，部分细胞系中表达率下降，可能与神经元向非肽能亚型转化有关。免疫染色证实tdT+神经元均表达ISLET和BRN3A，但TRKA激动剂capsaicin未引发显著钙响应，提示分化神经元仍处于发育早期阶段。
3. MAFA与RUNX3报告系统实现机械感受器与本体感受器标记
通过降低WNT信号并早期添加DAPT（Notch通路抑制剂），分化协议成功偏向机械/本体感受器生成。MAFA:tdT+神经元从DIV18开始出现，且全部共表达cMAF和TRKB（机械感受器标志）；RUNX3:tdT+神经元数量较少，但特异性共表达RUNX3蛋白。肌肉条件培养基可增强RUNX3+神经元富集，提示微环境信号对本体感受器成熟至关重要。
结论与意义
本研究建立的荧光报告hPSC工具集突破了体感神经元亚型分化的关键技术瓶颈：其一，实现实时可视化追踪，助力分化协议优化；其二，通过FACS分离特定亚型，支持单细胞层级分子与功能分析；其三，兼容3D类器官共培养系统，模拟神经元与靶组织互作。这些资源不仅推动PSN疾病建模，还为胰腺β细胞（MAFA相关）及免疫细胞（RUNX3相关）研究提供跨领域应用潜力。未来通过整合转录因子诱导与微环境调控，有望进一步提升神经元成熟度与功能多样性，加速精准医疗发展。
