《Bioactive Materials》：Synergistic mitochondrial homeostasis regulation and cholinergic circuits reconstruction via a one-step synthesized multifunctional hydrogel facilitates spinal cord injury repair
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本研究针对脊髓损伤后线粒体功能障碍导致活性氧（ROS）过度积累、严重损害内源性神经干细胞（NSCs）向神经元分化并阻碍神经再生的难题，开发了一种一步法合成的多功能PLCS水凝胶。该水凝胶具备可注射、自愈合、组织粘附及顺序药物释放特性，能优先释放线粒体靶向抗氧化肽SS31清除mtROS，随后持续释放硫辛酸（LA）和胆碱。研究证实PLCS水凝胶不仅能促进NSCs向胆碱能神经元分化，还能通过提升PDH活性增加乙酰辅酶A（acetyl-CoA）水平，并为乙酰胆碱（ACh）合成提供胆碱底物，从而在大鼠SCI模型中实现强劲的神经再生，并显著改善运动、感觉及膀胱功能。RNA测序提示PI3K-Akt通路可能参与修复过程。这种无需催化剂和有机溶剂的一步合成法为SCI及其他中枢神经系统损伤的临床转化提供了极具前景的新策略。
脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）是中枢神经系统遭受的严重创伤，常导致患者永久性的运动、感觉功能障碍，给全球医疗卫生系统带来沉重负担。创伤本身造成的原发性损伤固然严重，但随之而来的继发性损伤级联反应——包括线粒体功能障碍、活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）爆发性积累、神经炎症以及神经元大量死亡——往往是阻碍神经再生和功能恢复的关键。其中，线粒体作为细胞的能量工厂，其功能失调被认为是SCI后一种关键的病理机制和潜在的突破性治疗靶点。线粒体电子传递链的破坏会导致线粒体活性氧（mtROS）的爆炸性积累，这不仅引发细胞能量代谢崩溃，还会通过氧化损伤DNA、蛋白质和脂质等生物分子，加剧神经元凋亡和神经炎症。另一方面，脊髓中的胆碱能神经元在运动控制中扮演核心角色，其合成的乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）是调节肌肉运动的关键神经递质。SCI后，mtROS触发的级联反应会导致胆碱能神经元大量死亡并阻碍ACh合成，破坏神经元间的化学信号传递。激活内源性神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）使其分化为胆碱能神经元，以替代丢失的神经元并重建信号传导通路，是一种具有潜力的解决方案，同时能避免外源性NSC移植带来的免疫排斥和伦理问题。然而，SCI后由mtROS触发的病理微环境不仅会诱导NSCs偏向胶质细胞谱系分化，还会氧化损伤补充的外源性胆碱，最终导致修复失败。因此，如何有效清除mtROS，并协同重建胆碱能神经系统，成为SCI修复领域亟待解决的科学难题。
传统靶向线粒体的药物存在效率低、毒性大等问题，限制了其临床应用。水凝胶材料因其优异的物理特性和可定制的生物学功能，为应对上述挑战提供了策略性解决方案。其可注射性能够填充不规则的损伤空腔，粘附基团介导与脊髓组织的紧密结合，自愈合能力维持水凝胶结构完整性——这三者协同构建了神经再生的稳定微环境。然而，传统多功能水凝胶的制备需要复杂的多步过程，并依赖有机溶剂和催化剂，导致成本高、重现性差并可能产生有毒残留，严重阻碍其临床转化。此外，常规水凝胶载药能力和缓释效率有限，难以满足SCI微环境中持续清除ROS的需求。
针对上述挑战，发表在《Bioactive Materials》上的这项研究，报道了一种通过一步法合成的多功能水凝胶——Poly(LA-Cho)/SS31（PLCS）。该水凝胶以硫辛酸（LA）、胆碱碳酸氢盐和线粒体靶向肽SS31为原料，巧妙地将物理功能（可注射、自愈合、粘附）与生物功能（顺序释药、抗氧化、促神经分化）高效集成。研究人员通过一系列体内外实验，系统评估了PLCS水凝胶的物理化学性质、抗氧化效能、线粒体保护作用、对NSCs分化的影响以及在SCI动物模型中的治疗效果，并初步探索了其潜在的作用机制。
为开展本研究，作者团队运用了几个关键的技术方法：首先，他们通过一步热引发开环聚合（ROP）结合氢键交联，制备了PLCS水凝胶，并利用扫描电子显微镜（SEM）、核磁共振（1H NMR）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和流变学测量对其结构和力学性能进行了系统表征。其次，他们建立了H2O2诱导的PC12细胞氧化应激模型和大鼠脊髓全横断损伤模型，用于体外和体内功能验证。第三，他们采用荧光探针（如DCFH-DA、DHE、MitoSOX、JC-1）、蛋白质印迹（Western Blot）、免疫荧光染色、RNA测序（RNA-seq）以及运动诱发电位（MEP）和行为学评分（BBB评分、足迹分析）等多种技术，从分子、细胞、组织到整体动物水平全面评估了水凝胶的治疗效果和机制。研究所用动物为雌性Sprague Dawley大鼠，所有实验均遵循相关伦理规范。
2.1. PLC和PLCS水凝胶的合成与表征
研究人员将LA和胆碱碳酸氢盐（Cho）以1:0.6的摩尔比在PBS中混合，于65°C加热引发LA的五元环内二硫键发生开环聚合（ROP），形成聚(LA-Cho)（PLC）水凝胶。冷却至45°C后，均匀掺入SS31肽，得到最终的PLCS水凝胶。该制备过程无需有机溶剂或催化剂。PLCS水凝胶呈透明黄色，扫描电镜显示其具有多孔、松散互连的三维结构。流变学测试表明水凝胶的储能模量（G'）始终高于损耗模量（G''），形成了稳定的粘弹性固体，其刚度与天然脊髓组织相匹配，并具有良好的热稳定性和自愈合性能。水凝胶还表现出优异的组织粘附性和剪切稀化特性，可轻松通过20G针头注射。体外降解实验显示，在模拟SCI氧化微环境的H2O2存在下，水凝胶降解加速，表现出氧化还原响应性降解行为。药物释放研究表明，SS31在早期优先释放，而胆碱则呈现持续释放模式，这与SCI修复的病理过程需求相契合。
2.2. PLC和PLCS水凝胶的抗氧化性能
通过ABTS+•、•OH、O2?•和H2O2清除实验，证实PLCS水凝胶具有强大的广谱抗氧化活性，其效率显著高于不含SS31的PLC水凝胶。在细胞水平，利用H2O2诱导PC12细胞产生氧化应激，通过DCFH-DA和DHE荧光探针检测发现，PLCS水凝胶能有效降低细胞内总ROS和超氧阴离子水平。特别是使用MitoSOX Red探针和罗滕酮诱导模型，进一步证实PLCS水凝胶能特异性清除mtROS。
2.3. PLCS水凝胶减轻线粒体功能障碍
研究发现，从PLCS水凝胶中释放的SS31能快速靶向线粒体，且在H2O2存在的氧化应激环境下，其靶向效率增强。PLCS水凝胶能显著缓解H2O2引起的PC12细胞线粒体肿胀和嵴结构破坏，恢复线粒体膜电位（ΔΨm），提升细胞内ATP水平，并有效抑制mtROS产生和脂质过氧化。此外，水凝胶还能抑制线粒体DNA（mtDNA）释放至胞质，进而下调促炎因子IL-1β表达并上调抗炎因子Arg1表达，表明其通过“线粒体保护—抑制mtDNA释放—阻断炎症通路”的级联机制调节神经炎症微环境。
2.4. PLC和PLCS水凝胶的早期体内抗氧化和抗炎作用
在大鼠SCI模型植入水凝胶7天后，组织染色显示，与损伤组相比，PLCS水凝胶能更有效地清除损伤部位的ROS，降低促炎因子IL-1β表达，提高抗炎因子Arg1水平。免疫荧光和蛋白质印迹分析表明，PLCS水凝胶能显著减少神经元凋亡（cleaved caspase-3+/NeuN+细胞减少），并维持线粒体蛋白TOMM20和神经元标志物NeuN的表达，显示出显著的神经保护作用。
2.5. PLCS水凝胶修复SCI的潜在机制
RNA测序分析发现，PLCS水凝胶处理4周后，脊髓组织中有大量差异表达基因，这些基因富集在神经干细胞增殖、中枢神经系统分化、胆碱能突触传递等生物过程，以及PI3K-Akt信号通路和细胞外基质（ECM）-受体相互作用通路。Western Blot验证了PLCS水凝胶能上调p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的蛋白表达水平。体外实验表明，在氧化应激下，PLCS水凝胶能促进NSCs向Tuj1+神经元和ChAT+胆碱能神经元分化，且这一效应可被PI3K-Akt通路抑制剂所逆转。机制上，PLCS水凝胶通过释放的LA可能作为丙酮酸脱氢酶（PDH）复合体E2亚基的组分，增强PDH活性，促进丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶A（acetyl-CoA）；同时，持续释放的胆碱为ACh合成提供底物。体内实验证实，PLCS水凝胶植入4周后，损伤部位乙酰胆碱、乙酰辅酶A、胆碱水平及PDH活性均显著升高，并且观察到内源性NSCs（Nestin+）向神经元（Tuj1+）和胆碱能神经元（ChAT+）分化。
2.6. PLCS水凝胶促进神经传导和运动功能恢复
行为学评估显示，植入PLCS水凝胶8周后，大鼠的BBB评分显著提高，足迹分析显示后肢步长改善，部分承重能力恢复。运动诱发电位（MEP）记录表明，PLCS水凝胶组大鼠的双侧MEP振幅增高、潜伏期缩短，提示神经传导功能部分恢复。热板试验表明PLCS水凝胶组大鼠对热痛刺激的反应时间接近假手术组，感觉功能得到改善。组织学检查发现，PLCS水凝胶处理后的脊髓损伤部位组织修复良好，灰质和白质连续性恢复，神经纤维排列致密整齐。此外，PLCS水凝胶还改善了SCI后的神经源性膀胱功能障碍和腓肠肌萎缩。
2.7. PLCS水凝胶恢复受损脊髓的微观结构
植入8周后，免疫荧光染色显示，PLCS水凝胶组损伤部位仍可见Nestin+的NSCs和Nestin+/Tuj1+双阳性细胞，表明内源性NSCs持续激活并向神经元分化。同时，胶质瘢痕形成（Nestin+/GFAP+细胞）被抑制。神经丝蛋白NF200和突触蛋白Synapsin的共染色显示损伤部位有密集的再生神经纤维和突触形成。Western Blot结果进一步证实了PLCS水凝胶能显著提高损伤脊髓组织中NeuN、NF200和髓鞘碱性蛋白（MBP）的表达水平。
2.8. PLCS水凝胶的生物相容性
细胞毒性实验（CCK-8、活死染色）、细胞凋亡检测（Annexin V-FITC/PI）以及细胞划痕实验表明，PLCS水凝胶具有良好的细胞相容性，支持PC12细胞存活、增殖和迁移。体内血液生化分析和主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的组织学检查未发现PLCS水凝胶引起明显的全身毒性反应或病理学改变，证明其具有优异的体内生物安全性。
本研究成功开发了一种通过一步法合成的多功能PLCS水凝胶，用于脊髓损伤修复。该水凝胶通过顺序释放SS31和LA/胆碱，协同实现了靶向清除线粒体ROS、减轻线粒体功能障碍、促进内源性神经干细胞向胆碱能神经元分化以及支持乙酰胆碱生物合成的多重目标。其作用机制涉及激活PI3K-Akt信号通路，并可能通过提升PDH活性增加乙酰辅酶A供应。在动物模型中，PLCS水凝胶显著促进了脊髓组织的结构修复、神经再生和功能恢复（包括运动、感觉和膀胱功能），且展现出良好的生物相容性。该研究不仅提出了一种高效的脊髓损伤修复策略，其绿色、简易的一步合成方法也为其他中枢神经系统损伤的临床转化提供了新思路。研究的局限性在于体内实验未设置各单一组分的对照组，未来需要进一步系统比较各成分的生物学效应，并利用单细胞RNA测序等技术更精确地解析PLCS在不同细胞类型中的作用机制，为其临床转化奠定更坚实的基础。
