《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Development of human single-domain antibodies against influenza based on NA-targeting IgG
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针对流感A病毒神经氨酸酶（NA）开发高活性单域抗体的研究。通过载体移植和亲和恢复策略，成功获得两个完全人源sdAbs（IC50分别为0.82和0.59 μg·mL?1），克服了直接提取VH域的稳定性与活性问题，为吸入式流感治疗提供了新方向。
黄爱玲|李成|吴慧|孙文莉|霍珊珊|王娟|吴彦玲|应天雷|于飞
中国河北省农业大学生命科学学院人畜共患病病原微生物分析与控制重点实验室，河北071001
摘要
甲型流感病毒（IAV）的神经氨酸酶（NA）是一个重要的抗病毒靶点。然而，抗体需要精确识别催化口袋才能发挥抗病毒作用，这使得通过传统筛选方法难以获得有效的抗体。传统的IgG抗体还存在气溶胶化效率低的问题，限制了其在呼吸道给药中的效果。人源单域抗体（sdAb）仅包含重链的可变域（VH），由于其分子量小且具有优异的可吸入性，在对抗呼吸道病毒感染方面显示出巨大潜力；然而，直接从亲本IgG抗体中分离出的sdAb往往稳定性或结合活性会降低。为了克服这些障碍并加速获得针对NA活性口袋的完全人源sdAb，我们从广谱中和抗NA IgG中提取了VH域，并进行了支架嫁接及亲和力恢复处理。最终，我们获得了两种具有良好理化特性的完全人源sdAb，它们能够抑制H5N8 NA的酶活性，IC50值分别为0.82和0.59 μg·mL^-1。这项工作使得原本不溶的IgG VH片段能够以稳定且可溶的形式表达，并将其NA结合活性从无法检测的水平恢复到纳摩尔范围，为设计能够靶向结构受限病毒酶的完全人源sdAb提供了技术支持，这些抗体适用于吸入式流感治疗。
引言
甲型流感病毒（IAV）是一种主要的呼吸道病原体，持续威胁全球公共卫生。其基因组由八段负链RNA组成，编码多种蛋白质，包括血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。NA是一种位于病毒表面的四聚糖蛋白，通过切割宿主细胞和病毒颗粒表面的唾液酸来促进子代病毒的释放和传播。因此，它成为广谱抗病毒药物（如奥司他韦）的重要靶点[1][2]。值得注意的是，NA的催化中心由一系列高度保守的氨基酸残基构成（包括Arg118、Asp151、Arg152、Arg224、Glu276、Arg292、Arg371和Tyr406等）[3][4][5]，其抗原漂变率远低于HA。这些特性也使得NA成为开发具有持久交叉保护作用的治疗性抗体的理想靶点[6][7]。
尽管具有这些潜力，目前的NA靶向策略仍面临诸多挑战。由于H275Y等耐药突变频繁出现，患者对小分子抑制剂的临床敏感性显著下降[8][9]。同时，传统的单克隆抗体（IgG，约150 kDa）在通过气溶胶方式输送至呼吸道时的组织穿透性和效率较低，限制了其在感染部位的治疗效果[10][11]。
完全人源单域抗体（sdAb）仅包含重链的可变域，是自然界中最小的抗原结合片段，分子量约为12–15 kDa。它们源自骆驼科动物的对应物VHH，以其卓越的溶解性、稳定性、纳摩尔至皮摩尔范围内的高亲和力以及适合肺部给药的气溶胶化特性而闻名[12][13][14]。然而，开发针对NA的功能性人源sdAb仍然具有挑战性。有效的sdAb抑制需要精确识别NA的紧凑催化口袋，而该口袋仅由少数几个氨基酸组成，这使得通过传统筛选方法难以获得此类抗体。此外，天然的人源VH域需要与轻链（VL）配对才能保持结构完整性和抗原识别能力。当单独表达时，疏水界面的暴露会导致严重聚集，表达量极低（通常<0.1 mg/L）[15][16]。同时，由于缺乏参与抗原结合的轻链，单独的VH的结合活性可能会显著降低或完全丧失[17]。
为了解决这些问题，本研究从广谱中和抗NA IgG中分离出VH域，以提高发现针对NA催化口袋的sdAb的效率；然而，这样获得的sdAb无法以可溶形式表达。在将CDR（互补决定区）嫁接到高溶解性VH支架后，我们发现虽然VH恢复了溶解性，但完全丧失了抗原结合活性[18]。随后，我们采用控制性易错PCR（epPCR）和CDR饱和突变技术系统地构建了大规模抗体突变库，在保持结构框架稳定的同时增加了序列多样性[19][20]。最后，通过结合噬菌体展示和功能压力筛选，该策略旨在高效获得具有高亲和力和强酶抑制活性的完全人源sdAb，为快速设计能够靶向结构受限病毒酶的完全人源sdAb提供了技术支持，这些抗体适用于吸入式流感治疗。
细菌菌株、病毒和细胞系
大肠杆菌菌株HB2151、TOP10和TG1以及感受态细胞用于质粒扩增和噬菌体展示库的构建。辅助噬菌体KO7用于生成噬菌体库。禽流感病毒H9N2/A/environment/Hebei/GT19/2023和H5N8/A/swan/Hebei/BYD1/2021被用作中和试验中的挑战菌株，以评估候选抗体的抑制效果[21]。HEK293T和MDCK细胞购自美国典型培养物库。
支架嫁接以促进可溶性人源sdAb的表达
为了生成能够靶向NA的完全人源sdAb，我们选择了三种广谱IgG抗体1G04（PDB: 6Q1Z）、1E01（PDB: 6Q20）和1G01（PDB: 6Q23），它们的VH域与NA催化区域有关键接触。直接从这些抗体中提取的VH片段（分别命名为6Q1Z源、6Q20源和6Q23源）尽管经过多次优化，仍无法在多种表达系统中稳定表达，表明在从完整IgG中分离后存在严重的折叠缺陷。
讨论
开发针对NA的完全人源sdAb需要精确识别仅由少数几个氨基酸构成的催化口袋，这使得通过传统筛选方法难以获得此类抗体。此外，直接从亲本IgG中提取的VH片段由于疏水界面暴露而常常失去抗原结合活性，并且溶解性较差[16][25]。为了克服这些障碍并加速
利益冲突声明
作者声明本研究在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
CRediT作者贡献声明
王娟：资金获取、概念设计。
霍珊珊：资金获取、数据管理。
孙文莉：方法学设计、实验研究。
吴慧：方法学设计、实验研究。
李成：初稿撰写、数据可视化、验证、数据管理。
黄爱玲：初稿撰写、数据可视化、验证、方法学设计、实验研究、数据分析、概念设计。
应天雷：审稿与编辑、项目监督、资源协调、项目管理、资金支持。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（82574303资助TY，81974302资助FY，82303365资助JW）、河北省自然科学基金（H2021204001资助FY）以及保定市科技计划项目（2272P006资助FY，2372P012资助JW）的支持。
利益冲突声明
作者声明本研究在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
