《Cell Biomaterials》：An electro-responsive functional neurovascularized engineered muscle
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骨骼肌再生中，基于光诱导各向异性细胞片（ACS）技术和高精度3D打印柔性电极，开发出电响应功能性神经血管化工程肌肉（EFNEM），通过体内精准电刺激协同促进再生组织神经血管整合和功能恢复，为主动功能再生提供新策略。
施家丁|辛叶|陈月薇|王霞|庄莉|黄思荣|林玉琪|李胜杰|杨家超|何勇|何建祥|王慧明|于梦飞
浙江大学医学院口腔医学院口腔医院，浙江省口腔疾病临床研究中心，浙江省口腔生物医学研究重点实验室，浙江大学癌症中心，浙江省口腔生物材料与器械工程研究中心，中国杭州310000
摘要
天然骨骼肌具有自我修复的固有能力，可以通过肌纤维增殖和重塑实现部分恢复。然而，在肌肉体积丧失的情况下，传统的重建方法往往无法恢复功能完整性。在这项研究中，我们开发了一种电响应型功能性神经血管化工程肌肉（EFNEM），结合了柔性电极进行可控的体内电刺激（ES），以协同促进组织再生和功能恢复。利用光诱导各向异性细胞片（ACS）技术，我们构建了具有神经血管成分的排列有序的肌肉组织，模拟了基底膜（BM）的引导作用。高分辨率3D打印技术进一步实现了具有良好组织顺应性的柔性电极的制造，当与精确的体内电刺激结合时，加速了神经肌肉整合并改善了功能恢复。这种综合修复策略结合了体外构建和体内重塑，为实现功能修复提供了新的见解。
引言
骨骼肌是运动和代谢稳态的核心器官，其特点是具有强大的收缩能力和精确的神经肌肉协调性。
在肌肉体积丧失（VML）的情况下，严重损伤通常会导致肌肉纤维广泛破坏、去神经化和纤维组织沉积，共同损害了内在的再生能力，最终导致功能衰竭。
近年来，组织工程技术在解决VML方面取得了重要进展。包括多材料3D生物打印和仿生支架在内的先进方法在恢复肌肉体积方面显示出 promising 的效果，并在临床前模型中部分改善了功能恢复。
尽管取得了这些进展，但从被动结构修复向主动功能再生的转变仍然具有挑战性。当前策略中缺乏主动引导信号，阻碍了工程构造与复杂宿主组织之间的有效功能整合，从而限制了功能恢复的程度。因此，开发能够主动引导组织整合的再生策略可能是该领域的关键下一步。
为了设计这样的策略，我们分析了骨骼肌的发育和再生过程，确定了功能恢复的两个关键决定因素：（1）肌肉纤维的排列结构；（2）持续电信号的作用。在胚胎发育过程中，肌源性细胞通过感知生物力学信号（包括局部应力梯度和细胞外基质（ECM）硬度）获得极性，逐渐组装成方向一致、紧密耦合的肌肉束。
在再生过程中，受损肌肉纤维的残留基底膜（BM）作为天然的空间模板，为肌肉细胞的轴向排列和融合轨迹提供了物理支持。先前的研究表明，这种有序的架构不仅确保了高效的轴向力传递和通过平行肌纤维组装实现的同步收缩，还作为物理模板支持神经和血管网络的重建。
相反，无序的纤维排列会破坏机械传导并延迟动作电位的传播，严重损害肌肉组织的协调性和收缩效率。这些限制也反映在传统的随机再生策略中，其中细胞在没有空间或生物物理引导的情况下自发增殖和沉积ECM。虽然这种自我组织的修复可以恢复部分组织连续性，但缺乏有序的引导信号通常会导致组织组织异质性和功能恢复不完全，这突显了需要引导再生方法的重要性。
此外，骨骼肌的发育和功能成熟可以通过生物电活动精确调节。内源性电场（EFs）从早期胚胎阶段就存在，调节膜电位和钙稳态，从而指导极性建立和方向迁移等关键细胞事件。
在功能构建的后期阶段，尽管肌肉成熟和神经支配主要通过内在的发育程序进行，正如在没有外源性电刺激（ES）的优化体外系统中观察到神经肌肉接头（NMJ）的形成所示，电信号仍然被认为是优化和加速这一过程的关键因素。特别是在体内再生环境中，受控的电输入被认为有助于肌纤维成熟并支持NMJ的功能维持。从机制上讲，电信号可以调节钙离子通道，从而精确控制细胞内钙动态，维持肌肉生理功能所需的收缩-松弛周期。
为此，我们提出了一种仿生策略，将结构引导与信号调节结合起来进行功能再生。我们通过仿生重建排列有序的肌肉纤维并整合神经支配和血管网络，开发了一种电响应型功能性神经血管化工程肌肉（EFNEM），从而建立了具有主动响应性和多因素协调性的再生框架。具体来说，利用光诱导各向异性细胞片（ACS）技术模拟天然肌肉纤维BM的空间引导功能，构建了高度排列的神经血管化肌肉组织。同时，制造了高分辨率3D打印的柔性电极，以提供精确的体内电刺激，显著增强了神经肌肉整合并加速了功能恢复（图1）。这一策略代表了从被动结构替代向主动功能重建的关键进步，为组织工程提供了一个多功能和可推广的范例，为多因素引导的功能性肌肉再生开辟了有希望的途径。
肌肉纤维排列无序会损害功能恢复
骨骼肌具有自我再生的固有能力；然而，我们的研究表明，损伤后的再生仍然伴随着功能损害。为了研究生理肌肉再生过程，我们在小鼠中建立了自我限定的肌肉缺陷（SLMD）模型。使用CatWalk系统在损伤后4周进行步态分析，结果显示SLMD小鼠的打印面积和步态强度明显低于对照组，表明
讨论
功能性肌肉再生依赖于多个因素的协调作用，但传统治疗方法通常侧重于单个组织结构的重建，从而限制了全面的功能恢复。
在这项研究中，我们分析了骨骼肌再生和发育的关键生物学过程，并提出了一种创新的生物启发策略，整合了肌肉纤维排列、神经血管化和电信号
TNF的制备
TNF是通过相分离诱导的自组装方法在基底上制备的。简而言之，含有四丁氧基钛（TBOT）（北京国药化学试剂公司）、乙酰丙酮（AcAc）（上海凌峰化学试剂公司）和聚乙烯吡咯烷酮（PvP）（国药化学试剂公司）的前体溶液被旋涂到石英基底（10 × 10 × 1 mm3）上。然后，涂覆的基底在500°C下热处理1小时，并在黑暗环境中储存1小时
联系人
材料可用性
本研究没有生成新的独特试剂。
数据和代码的可用性
支持本文发现的所有实验数据可在合理请求下从相应作者处获得。
致谢
我们感谢浙江大学医学院的核心设施提供的共聚焦显微镜和技术支持。感谢浙江大学的D.Q. You、M.Y. Sun、C. Liu、X.W. Yu和Q. Li的有益讨论和帮助。这项工作得到了国家重点研发计划（编号：2023YFB3813003）、国家自然科学基金（编号：82430031、82122014和823B2016）以及国家博士后科学基金的财政支持。
作者贡献
S.D.、X.Y.和Y.C.对这项工作做出了同等贡献。S.D.、X.Y.和Y.C.负责概念设计和设计、数据收集和/或组装、数据分析和解释以及手稿撰写；Z.L.、X.W.、Y.L.和S.L.负责材料准备和数据分析；S.H.负责手稿修订和数据分析；J.Y.负责EMG分析和数据处理；Y.H.、J.H.、H.W.和M.Y.负责概念设计、财政支持、行政支持、手稿修订/编辑以及最终批准
