《ACS Omega》：CRISPR/Cas9-Mediated Metabolic Engineering of Endophytic Pseudomonas loganensis sp. nov. for the Production of Nutritionally Valuable Carotenoids
引言：类胡萝卜素的价值与生产挑战
类胡萝卜素是一类由异戊二烯单元构成的萜类色素分子，广泛存在于光合生物中。根据其碳原子数可分为C30、C40和C50类，其中C40类胡萝卜素因在自然界中含量丰富而被研究得最为深入。依据结构中的官能团，类胡萝卜素可分为只含碳氢结构的胡萝卜素（如β-胡萝卜素、番茄红素）和含氧的叶黄素（Xanthophylls），后者根据含氧官能团的不同又可进一步分为羟基类、环氧类和酮类胡萝卜素。
类胡萝卜素对人类健康至关重要，主要归功于其强大的抗氧化特性。此外，它们还被报道具有抗病毒、抗糖尿病、抗癌和维生素A原活性。已证实的健康益处包括提高认知能力、降低慢性病风险、预防年龄相关性眼病等，因此在制药行业受到关注。例如，β-胡萝卜素是维生素A的前体，对眼睛功能起着关键作用。虾青素则被建议通过抑制细胞因子风暴来增强COVID-19的治疗效果。由于动物和人类无法自身合成类胡萝卜素，必须通过饮食或补充剂摄入。因此，它们作为食品成分对人类健康有益。此外，类胡萝卜素生物强化饲料和食品可能为对抗维生素A缺乏症提供一种有前景的策略。它们通常用作食品着色剂、蛋黄和水生生物着色的天然色素。所有这些益处使其在多个行业中具有广泛用途，并增加了对类胡萝卜素的需求。类胡萝卜素市场规模巨大，预计将从2017年的15亿美元扩大到2026年的20亿美元。
目前类胡萝卜素的供应链主要依赖于植物提取和化学合成。然而，这些策略存在一些缺点和瓶颈。化学合成和植物提取过程中使用的有机溶剂会引发环境问题，而气候多变性和季节性变化等因素影响植物的可获得性。此外，种植富含类胡萝卜素的植物成本高且耗时。由于化学合成产生的合成类胡萝卜素可能导致毒性增加和过敏性等健康问题，这促使人们对微生物生产作为替代方案的兴趣日益增长。微生物生产可以克服这些缺点和瓶颈，并提供一种更可持续和高效的方法。事实上，由于其可扩展性、效率和较低的成本，微生物生产对于满足工业需求至关重要。目前，微藻、细菌和真菌常被用作类胡萝卜素微生物生产者。此外，代谢工程策略促进了类胡萝卜素在非天然微生物宿主中的生物合成。基因工程技术已被用于提高类胡萝卜素的产量。
鉴于支持不断增长的人口的可持续营养源的迫切需求，微生物生产平台提供了一种可持续且环境友好的解决方案。合成生物学使得开发此类平台以生产高价值营养素（如类胡萝卜素）成为可能，这些营养素对视觉、免疫功能和抗氧化防御至关重要。特别是，CRISPR介导的代谢工程可以通过实现营养有价值化合物（包括类胡萝卜素）的精密发酵，为全球粮食安全做出重大贡献。基因工程微生物支持可持续的生产平台，这些平台可以独立于农业限制（如气候不稳定、土地稀缺和作物产量波动）而运行。本研究旨在通过提供可持续、环境友好且非植物基的食品成分生产，为全球实现联合国可持续发展目标2（零饥饿）的努力做出贡献。
植物相关微生物，即内生菌，是天然产物的可行来源。它们能够合成具有多种生物活性的初级和次级代谢产物，这些代谢产物影响宿主代谢。因此，内生菌是新型生物活性化合物的丰富宝库。此外，现代遗传工具使得能够改造内生菌，以利用其生产各种抗菌、抗病毒和抗癌分子的潜力。Pseudomonas sp. 102515最初是从中国红豆杉叶片中分离得到的一种内生菌。在最近的研究中，该菌株经过生化鉴定，其基因组分析表明它是一个新的假单胞菌物种，并被重新命名为Pseudomonas loganensis sp. nov.。该分离株显示黄色色素沉着，这导致发现它天然产生玉米黄质二葡萄糖苷。对其类胡萝卜素生物合成基因簇的表征表明，通过敲除某些类胡萝卜素基因，可以产生如番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄质等关键中间体。例如，crtY负责番茄红素的环化，导致β-胡萝卜素的生物合成。因此，敲除crtY会导致工程菌株中番茄红素的积累。除了作为具有功能性生物合成基因簇的天然类胡萝卜素生产者外，P. loganensis sp. nov. 能够在相对较高的盐浓度下生长，表明其内生生活方式可能赋予其盐胁迫耐受性。这种耐盐胁迫能力可以带来经济效益，因为它允许在工业发酵期间的高渗透压条件下进行更有效的生产。此外，据报道它能够从麦芽糖合成海藻糖，其固氮能力进一步强调了其在农业应用中的潜力。这些特性共同使P. loganensis sp. nov. 成为一个有吸引力的利基微生物底盘。
材料与方法
菌株、培养基和质粒
研究中使用的菌株和质粒列于表中。通常，大肠杆菌Top10细胞用于克隆实验，而P. loganensis sp. nov. 用于遗传操作和类胡萝卜素生产。所有步骤均使用LB培养基进行细菌培养，根据需要添加细菌学琼脂和抗生素。LB培养基补充有卡那霉素（大肠杆菌为50 μg/mL，P. loganensis sp. nov.为30 μg/mL）、氨苄青霉素（100 μg/mL）、庆大霉素（35 μg/mL）和四环素（大肠杆菌为10 μg/mL，P. loganensis sp. nov.为25 μg/mL）。培养条件维持在大肠杆菌Top10为37°C，P. loganensis sp. nov.为28°C，转速均为220 rpm。
质粒构建
使用列出的引物通过Phusion DNA聚合酶进行PCR扩增。标准PCR反应在标准PCR条件下进行。为重叠延伸PCR开发了修改方案：反应混合物包含0.25 μM正向引物、0.25 μM反向引物、1×缓冲液、400 μM dNTPs、3% DMSO、可变量的模板、0.02 U/μL Phusion DNA聚合酶和高达20 μL的dH2O。前20个循环在不加引物的情况下进行以允许片段重叠，之后加入引物，并在相同标准条件下继续进行额外的循环。
构建带有靶基因同源臂的pJOE载体：提取P. loganensis sp. nov.的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增crtX、crtY和crtZ基因的上游和下游同源臂。扩增的同源臂从琼脂糖凝胶中纯化，通过重叠延伸PCR使用上游正向和下游反向引物进行杂交和扩增。用BamHI和PmlI限制性内切酶消化pJOE_pvdJ质粒。将消化后的pJOE_pvdJ和杂交的上游-下游同源臂从凝胶中纯化，并通过吉布森组装进行连接。通过限制性酶切分析和桑格测序验证构建的质粒。
构建带有靶基因N20序列的pgRNAtet载体：为了构建pgRNAtet，将质粒通过PCR扩增为两个片段，并通过引物改变基因特异的N20 PAM序列。首先，使用pgRNAtet-F和pgRNAtet-R引物对获得1.6 kb片段。然后，使用pgRNAtet-CrtXYZ-R和pgRNAtet-CrtX-F引物产生带有crtX基因特异性N20序列的1.9 kb片段。这两个PCR产物从琼脂糖凝胶中纯化，并通过吉布森组装连接。对crtY和crtZ基因遵循相同的方案，但使用pgRNAtet-CrtY-F和pgRNAtet-CrtZ-F引物代替pgRNAtet-CrtX-F引物。通过限制性酶切分析和桑格测序验证构建的质粒。
构建过表达质粒：将crtW基因合成为基因块，用引物25-26通过PCR扩增，并从凝胶中纯化。首先将平末端的PCR产物克隆到pJET1.2中，得到pNAr11。用于连接的体系包括50-100 ng载体、插入片段（载体/插入片段摩尔比为5:1）、1 μL 10× T4连接酶缓冲液、1 μL PEG缓冲液（用于平末端连接）、0.5 μL T4 DNA连接酶和高达10 μL的dH2O。连接反应在冰上孵育30分钟，然后在18°C过夜。用PmeI和SpeI切割构建体pNAr11和具有pMiS1载体骨架的载体pNAr17，从凝胶中收集并纯化所需条带。将从pNAr11限制性酶切获得的粘性末端crtW片段，通过T4 DNA连接酶插入到从pNAr17酶切获得的pMiS1载体骨架中，得到pNAr18。通过限制性酶切分析和桑格测序验证构建的质粒。
P. loganensis sp. nov.的转化和遗传工程
通过电穿孔将质粒转化到P. loganensis sp. nov.细胞中。根据文献制备电感受态细胞。通过将培养物生长至OD600~0.4，在冰上收集，并用300 mM蔗糖洗涤三次来制备电感受态细胞。将细胞重悬于100 μL蔗糖中，与质粒DNA混合，在冰上孵育10分钟，然后在2.5 kV和25 μF条件下进行电穿孔。立即在1 mL LB中于28°C恢复2小时，然后涂布在选择性LB琼脂平板上，于28°C培养2天。将转化子传代培养并接种到含有适当抗生素的LB中供进一步使用。
对于λRed/Cas9介导的基因组编辑，根据Pfleger及其同事的方法进行两步电穿孔。将含有pCas9的P. loganensis sp. nov.细胞用pJOE转化，并在Gen35+Kan30 LB琼脂平板上进行选择。将种子培养物生长至OD600~0.4，用0.2% L-阿拉伯糖诱导15分钟，然后按照所述方案再次制备电感受态细胞用于pgRNAtet转化。在Gen35+Tet25平板上选择转化子。
通过在无抗生素的LB中生长并反复划线直至在选择平板上无生长来去除CRISPR-Cas9质粒。然后将过表达质粒pNAr18引入无质粒的P. loganensis sp. nov. ΔcrtX细胞中，在Kan30 LB琼脂上选择转化子。
类胡萝卜素生产的摇瓶培养
将工程化P. loganensis sp. nov.菌株的单个菌落分别接种到5 mL含有适当抗生素的LB培养基中，在28°C、220 rpm振荡培养2天。摇瓶培养以2天种子培养物的0.5%接种量开始，根据需要添加抗生素。6小时后，向P. loganensis sp. nov. ΔcrtX/pNAr18培养物中添加0.2% L-鼠李糖以诱导虾青素生产。培养物在28°C、220 rpm振荡培养5天后进行提取。
PCR确认
提取野生型P. loganensis sp. nov.和敲除菌株的基因组DNA，作为模板，使用相同的引物对确认crtX、crtY和crtZ基因的敲除。由于基因缺失，预期敲除菌株的DNA片段更短。对其它敲除菌株应用相同的方案，使用表中列出的引物对。
类胡萝卜素提取
将培养5天的培养物在6000g离心10分钟以收集细胞。弃去上清液，加入等量的丙酮:甲醇:氯仿混合物。对每50 mL培养物超声处理1分钟以促进类胡萝卜素提取，然后在8000g离心15分钟以去除细胞碎片。收集上清液并使用旋转蒸发仪干燥。将残留物重新溶解于丙酮:甲醇:氯仿溶剂混合物中用于进一步分析。
薄层色谱和高效液相色谱分析
使用涂有荧光指示剂F254的硅胶板进行薄层色谱分离类胡萝卜素。展开剂由丙酮:正己烷:dH2O组成。使用类胡萝卜素标准品作为阳性对照，野生型P. loganensis sp. nov.提取物作为阴性对照。
通过高效液相色谱进一步分析提取的类胡萝卜素。分析在反相C18分析柱上进行。HPLC仪器配备光电二极管阵列检测器，色谱图在454 nm处记录。使用乙腈:甲醇:异丙醇作为流动相，采用等度洗脱方法分析提取的类胡萝卜素，流速为1 mL/min，柱温箱温度为40°C。
使用响应面法优化培养基
将P. loganensis sp. nov.敲除和过表达菌株的单个菌落分别接种到5 mL LB培养基中获得种子培养物。然后使用六种不同碳源和五种氮源进行试管实验。所有碳源和氮源均单独测试。此外，还测试了不同浓度的碳源和氮源、不同温度和pH值范围。每个试验以1%的接种量开始，并独立进行三次重复。在第3、5和7天收集样品用于类胡萝卜素提取。在每种类胡萝卜素的特定OD值下分光光度法分析提取物，并使用真实的类胡萝卜素标准品生成标准曲线。基于这些校准方程计算类胡萝卜素浓度。HPLC分析的曲线下面积计算包含在滴度计算中，以排除杂质和其他类胡萝卜素的贡献。使用GraphPad Prism 8.0.2生成图形并进行统计分析。根据p值表示显著性水平。
在单独确定最有效的碳源和氮源后，使用Design-Expert 7.0.0应用响应面法以确定增强类胡萝卜素生产的最佳培养基。首先建立Box-Behnken设计以构建包含多个实验因素的模型。执行BBD生成的实验运行，软件提供最佳设计参数。随后在含有5 mL培养物的50 mL Falcon管和含有100 mL培养物的250 mL摇瓶中，使用独立的三次重复验证这些优化的培养基组成。此外，在优化的培养基组成和条件下测试了不同的接种量。使用Design-Expert 7.0.0版对RSM结果进行统计分析。
结果
通过P. loganensis sp. nov. ΔcrtX生产玉米黄质
在野生型P. loganensis sp. nov.的生物合成途径中，最终产物是玉米黄质二葡萄糖苷，它是由玉米黄质通过玉米黄质葡萄糖基转移酶（CrtX）催化向两个β环添加葡萄糖分子而合成的。当crtX基因从基因组中敲除后，预期的最终产物是玉米黄质。通过PCR确认了crtX的敲除，产生了P. loganensis sp. nov. ΔcrtX菌株。首先使用TLC分析玉米黄质的生产，这是一种基于极性差异进行化合物分离的经济高效且快速的色谱方法。
从P. loganensis sp. nov. ΔcrtX细胞沉淀中获得的有机类胡萝卜素提取物，使用所述方法通过HPLC进一步分析。突变菌株提取物和标准类胡萝卜素的HPLC色谱图显示，所有样品在3.53至3.92分钟之间洗脱，形成两个不同的峰。检查它们的UV谱以确认这些峰对应于类胡萝卜素。两个峰具有几乎相同的保留时间和UV谱，最大吸收在452 nm，证实它们代表玉米黄质异构体。此外，P. loganensis sp. nov. ΔcrtX提取物的HPLC分析显示在9.64分钟处有一个额外的峰，该峰表现出番茄红素特有的UV谱。这一发现与TLC分析一致。在已鉴定的P. loganensis sp. nov.类胡萝卜素生物合成基因簇中，crtY基因位于crtX基因的下游。由于细菌转录的多顺反子性质，靶向单个基因可能潜在地破坏上游和下游基因的转录和翻译。因此，在P. loganensis sp. nov. ΔcrtX中观察到的番茄红素积累可能是由于crtX敲除后crtY表达受损所致。在基因组中，crtX和crtY相邻定位，敲除crtX可能影响了crtY的表达。这种影响似乎是部分的，因为仍然产生玉米黄质；然而，由于它们位于同一个操纵子中，crtY的表达很可能因crtX缺失而降低。
为了确定玉米黄质生产的最佳条件，单独测试了各种参数，包括不同的碳源、氮源、温度和pH值。根据滴度，甘油和鼠李糖被确定为玉米黄质生产最有效的碳源，而蛋白胨和麦芽提取物是最有效的氮源。在LB培养基的标准生长条件下，P. loganensis sp. nov. ΔcrtX产生约2.33 mg/L玉米黄质。补充0.5%甘油将产量提高到4.34 mg/L，大约是基础培养基的2倍，而补充1%麦芽提取物进一步将产量提高到6.90 mg/L，几乎是基础条件的3倍。
为了构建具有三个自变量（甘油浓度、麦芽提取物浓度和培养时间）的BBD，选择了这些参数。使用RSM统计评估这些参数对类胡萝卜素生产的影响，并确定最佳培养基组成。预测的最佳组成为0.5%甘油、2%麦芽提取物和10天培养时间，预测生产滴度为15.61 mg/L。然后在优化的组成下，使用不同的接种量在Falcon管和摇瓶中进行验证实验。在这些条件下，P. loganensis sp. nov. ΔcrtX在Falcon管中以1%接种量产生约13.4 mg/L，在摇瓶中以2%接种量产生约11.3 mg/L。
如表S2所示，鼠李糖在P. loganensis sp. nov. ΔcrtX中提供了更大的玉米黄质滴度增强。然而，由于鼠李糖成本高于甘油，最初未使用鼠李糖进行BBD优化。尽管甘油作为碳源对于大规模应用具有经济优势，但后来使用三个自变量进行了BBD：鼠李糖浓度、麦芽提取物浓度和培养时间。统计评估这些参数对玉米黄质生产的影响，并通过RSM预测最佳培养基组成。预测的最佳组成为1.97%鼠李糖、1.98%麦芽提取物和9.45天培养时间，估计生产滴度为29.99 mg/L。评估了RSM模型的统计显著性。对于包含甘油、麦芽提取物和培养时间的模型，F值为10.20，相应的p值为0.001，表明模型具有统计学显著性。类似地，对于包含鼠李糖、麦芽提取物和培养时间的模型，F值为44.07，p值<0.0001，也表明具有很强的统计学显著性。然后在优化的培养基条件下，使用不同的接种量在摇瓶中进行验证实验。以2%接种量获得了35.0 mg/L玉米黄质的最高滴度，相对于LB基础培养基提高了15倍。
通过P. loganensis sp. nov. ΔcrtZ生产β-胡萝卜素
β-胡萝卜素是一种呈现橙色的类胡萝卜素，具有维生素A原活性。其β环被β-胡萝卜素羟化酶（CrtZ）羟基化导致玉米黄质的形成。从野生型P. loganensis sp. nov.基因组中敲除crtZ基因，产生了P. loganensis sp. nov. ΔcrtZ菌株，该菌株产生β-胡萝卜素作为最终产物。
与crtX敲除类似，通过PCR确认了crtZ的敲除，并通过TLC分析了β-胡萝卜素的生产。P. loganensis sp. nov. ΔcrtZ细胞沉淀的有机类胡萝卜素提取物通过HPLC进一步分析。β-胡萝卜素峰在14.90至15.36分钟之间洗脱。标准和提取物均显示出类胡萝卜素特有的UV谱，最大吸收在452 nm。HPLC分析证实了crtZ敲除的成功和工程菌株中β-胡萝卜素的生产。β-胡萝卜素和番茄红素都是非极性类胡萝卜素，β-胡萝卜素的极性略低于番茄红素。因此，β-胡萝卜素通常洗脱时间较晚，具体取决于流动相。然而，由于它们的极性差异极小，番茄红素也可能根据流动相的极性在较晚的保留时间洗脱。
为了确定β-胡萝卜素生产的最佳培养条件，单独测试了各种参数。在碳源中，0.5%甘油最有效，产生19.15 mg/L的β-胡萝卜素。在氮源中，1%麦芽提取物最有效，滴度为17.11 mg/L。在LB培养基的正常生长条件下，P. loganensis sp. nov. ΔcrtZ产生约4.72 mg/L β-胡萝卜素。相比之下，补充0.5%甘油或1%麦芽提取物使产量提高了近4倍，分别达到19.15和17.11 mg/L。
为了构建BBD，选择了三个独立参数：甘油、麦芽提取物和培养时间。执行实验运行，并使用RSM统计确定最佳培养基组成。β-胡萝卜素生产的最佳组成预测为2%甘油、2%麦芽提取物和5天培养时间，预测滴度为27.47 mg/L。β-胡萝卜素生产的RSM模型也经过统计验证。模型的F值为7.44，相应的p值为0.0038，表明模型具有统计学显著性。然后在优化的培养基组成下，使用不同的接种量在Falcon管和摇瓶中进行实验。P. loganensis sp. nov. ΔcrtZ在Falcon管中以1%接种量产生约23.53 mg/L β-胡萝卜素，在摇瓶中产生21.74 mg/L。
通过P. loganensis sp. nov. ΔcrtY生产番茄红素
番茄红素是第一个C40类胡萝卜素，其结构中缺乏环状基团。它通过番茄红素环化酶的催化作用作为合成环状和双环类胡萝卜素的前体。番茄红素β-环化酶（CrtY）在番茄红素的两端引入β环，将其转化为β-胡萝卜素。由于crtY基因从野生型P. loganensis sp. nov.基因组中敲除，预期的最终产物是番茄红素。通过PCR确认了crtY的敲除，并通过TLC分析了P. loganensis sp. nov. ΔcrtY的有机类胡萝卜素提取物，确认了番茄红素的生产。
从P. loganensis sp. nov. ΔcrtY细胞沉淀中获得的有机类胡萝卜素提取物然后通过HPLC分析，确认番茄红素生产的色谱图如图所示。在所有样品中，相应的番茄红素峰在9.34至9.54分钟之间洗脱。这些峰的UV谱如图所示。UV吸收谱显示出三个峰，最大值在444、471和503 nm，与文献中报道的番茄红素一致。这些发现证实了crtY基因的成功敲除和工程菌株中番茄红素的生物合成。
在随后的番茄红素生产优化过程中，单独测试了相同的参数。在碳源中，甘油最有效，番茄红素滴度为5.47 mg/L。类似地，麦芽提取物被确定为最有效的氮源，番茄红素滴度为3.95 mg/L。在正常生长培养基下，P. loganensis sp. nov. ΔcrtY产生约2.02 mg/L番茄红素。补充2%甘油将滴度提高到5.47 mg/L，大约是正常条件下的两倍，而添加1%麦芽提取物产生3.95 mg/L番茄红素，也显著高于基础培养基。
为了进一步优化工程菌株中的番茄红素生产，使用三个独立参数构建了BBD：甘油、麦芽提取物和培养时间。执行实验运行，结果使用Design-Expert 7.0.0进行统计评估，并通过RSM用于确定最佳培养基组成。预测最佳培养基组成为0.57%甘油、1.94%麦芽提取物和9.97天培养时间，预测番茄红素滴度为13.5 mg/L。番茄红素生产的RSM模型具有统计学显著性，F值为26.75，相应的p值为0.0001。在优化条件下，使用不同的接种量在Falcon管和摇瓶中进行验证实验。P. loganensis sp. nov. ΔcrtY在Falcon管中以1%接种量产生约9.67 mg/L番茄红素，在
