《ACS Electrochemistry》：Ion-Mediated Adsorption of Amyloid-β Peptides at the Liquid/Liquid Interface: Insights from Electrochemistry and Molecular Dynamics Simulations
编辑推荐：
本综述通过电化学技术（如循环伏安法CV、交流阻抗法）与分子动力学（MD）模拟相结合，深入探讨了β-淀粉样肽（Aβ）及其Cu(II)配合物在水/1,2-二氯乙烷（DCE）界面处的吸附行为。研究揭示了界面电荷调控、离子-肽相互作用以及肽构象灵活性对Aβ吸附的关键影响，为理解阿尔茨海默病（AD）相关肽在生物界面上的聚集机制提供了分子层面的新见解，并建立了软界面肽行为研究的有效框架。
引言
蛋白质或肽在界面处的聚集和吸附与神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）的发生和发展密切相关。然而，针对这些聚集体的疗法迄今效果有限，这凸显了迫切需要更深入地理解肽、蛋白质及其过渡金属配合物如何与生物界面相互作用。两种不混溶液体电解质溶液之间的界面（ITIES）可以作为一个简化的模型来模拟复杂的生物界面。它是一个易于操作的系统，为研究此类早期吸附和离子转移过程提供了一个受控的环境。ITIES可以通过外部施加的电场进行控制，从而能够研究离子或电子转移以及吸附过程。电化学技术为评估肽吸附和聚集提供了一个成本效益高且易于操作的平台，可作为研究软界面上生物分子相互作用的原理验证模型。
以往的研究已经在液/液界面上探索了多种生物相关分析物，包括二肽、肽、酶以及其他蛋白质，如牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白（HEWL）或血红蛋白。例如，有研究在裸露的和仿生的水/1,2-二氯乙烷（DCE）界面上研究了ε-聚-L-α-赖氨酸（一种聚阳离子异肽）的离子转移。Méndez等人还使用经磷脂修饰的仿生液/液界面研究了血管紧张素III和亮氨酸脑啡肽的吸附、界面络合和离子转移。Arrigan等人和Amemiya等人此前已对ITIES上的肽和蛋白质研究进行了全面的概述。此外，Arooj等人观察到吸附的分析物与有机电解质离子之间存在强烈的静电相互作用，例如HEWL在水/DCE界面的情况。通过双相电喷雾电离质谱（MS）研究进一步证实了溶菌酶与两种不同有机阴离子在水/DCE界面的相互作用，表明两种阴离子都与溶菌酶相互作用。这些发现共同强调了界面吸附中涉及的多方面作用力，使得电化学解释，特别是对于大生物分子，变得复杂。
为了克服这种复杂性，包含生物相关结合基序的短肽序列提供了一个实用的替代方案。此类片段保留了全长蛋白质的关键功能特征，并且易于合成和定制，以研究全长淀粉样蛋白的致病性和聚集性。特别地，将电化学数据与原子级模拟相结合，提供了一种强大的策略来解析带电界面处的界面相互作用和吸附机制。较小的肽模型在计算可处理性和生化相关性之间取得了平衡，使得能够更清晰地解释电化学信号，而不会过度简化分子复杂性。分子动力学（MD）模拟在揭示淀粉样肽构象景观的原子级见解方面已被证明是不可或缺的，弥补了实验在空间分辨率上的局限性。
研究β-淀粉样肽（Aβ）在液/液界面的行为尤其重要，因为此类环境可以促进与阿尔茨海默病（AD）相关的聚集机制。Aβ肽与细胞膜或脂质表面的相互作用由于其动态和异质性，目前仍知之甚少。这些相互作用基于静电或疏水作用力，可以在ITIES上进行研究，以更好地理解Aβ的毒性。Cu(II)络合不仅影响Aβ的聚集动力学，还影响其氧化还原化学，这两者都与AD的病理机制有关。值得注意的是，Cu(II)结合位点位于Aβ的前16个氨基酸残基内，使得该区域成为理解金属诱导构象变化和聚集行为的一个战略性靶点。短肽序列为这些相互作用提供了有价值的见解，是研究Aβ–Cu(II)配合物的有效模型。
本研究调查了两种Aβ衍生肽及其Cu(II)配合物在水/DCE界面的吸附行为。这些肽（如方案1所示）在Cu(II)结合和游离状态下均被检测。通过聚焦于可溶的N端片段，我们剖析了Cu(II)配位如何调节肽在极化界面处的行为。通过分离关键的Cu(II)结合基序，我们旨在阐明它们在界面驱动吸附过程中的作用。这些见解可能有助于在分子水平上理解Aβ–Cu(II)与生物膜的相互作用。本研究采用循环伏安法（CV）和交流伏安法来表征肽吸附和Cu(II)络合，同时利用原子级MD模拟揭示构象偏好、表面结合取向以及铜诱导的结构变化。这些见解有助于阐明控制Aβ–Cu(II)在液/液界面相互作用的物理化学因素，可能有助于建立更好的疾病相关聚集模型。
材料与方法
电化学设置
所有电化学实验均使用Autolab（PGSTAT128N, Metrohm Autolab B.V., Utrecht, The Netherlands）和Nova软件（Version 2.1.6., Metrohm Autolab B.V., Utrecht, The Netherlands）进行。电化学阻抗谱（EIS）和交流（AC）伏安法使用频率响应分析器模块（FRA2, Metrohm Autolab B.V., Utrecht, The Netherlands）测量。所有实验均在四电极配置下的ITIES上进行。使用两根铂丝作为对电极，两根银/氯化银（Ag/AgCl）准参比电极，分别置于有机相和水相中。测量在两种电化学电池配置中进行，每种配置包含含有10 mM氯化锂（LiCl）的水相和作为有机相的1,2-二氯乙烷（DCE），有机相中使用双（三苯基磷亚基）铵四（五氟苯基）硼酸盐（BATB）和双（三苯基磷亚基）铵四（4-氯苯基）硼酸盐（BATPBCl）作为支持电解质，如方案2所示。有机参比电极保持在1 mM BACl/10 mM LiCl的水性参考溶液中，以稳定有机参比电极的电位。
所有测量均在室温和水相pH 5.6下进行。选择该pH值是为了确保 respective Aβ–Cu(II)配合物的稳定性（在更低pH下的测量在支持信息中描述）。将肽加入水相，它们在水/DCE界面的吸附由外部施加的电位控制。选择Aβ1-16和Aβ4-16是因为它们与散发性AD患者大脑中发现的主要亚型Aβ1-42和Aβ4-42相关。这些短的天然无序肽具有分布的电荷，缺乏稳定的分子内结构，使得所有残基都能自由地与界面相互作用。两种Aβ肽均以方案1中给出的配位模式与Cu(II)离子形成配合物。Cu(II)配合物是通过向含有5 μM Aβ肽的水相中加入CuCl2溶液原位形成的，Aβ:Cu(II)比例为1:0.9，以确保溶液中没有游离的Cu(II)离子。Cu(II)在相关电位范围内不会在CV中产生显著信号。化学细节和进一步的实验设置在支持信息中提供。
分子动力学模拟与分析
使用Schr?dinger Maestro软件包并根据参考文献，在pH 5.5下指定了Aβ1-16和Aβ4-16的残基质子化状态，结果Aβ1-16净电荷为+2，Aβ4-16净电荷为+4，Aβ4-16–Cu(II)净电荷为+2。将模拟盒子（5 nm × 5 nm × 20 nm）填充水和DCE分子，形成每相跨度10 nm的水相|有机相双相溶剂。为了模拟在伽尔瓦尼标度上施加的+0.35 V正电位，将界面处的电解质离子（水中的Li+离子和DCE中的TB–离子）的浓度缩放至体相浓度的7.5倍。浓度的增加是基于从5 μM Aβ4-16的积分微分电容估算的+0.35 V下的电荷计算的。使用Gromacs软件包和CHARMM36m力场在正电位下进行了分子动力学（MD）模拟。Cu(II)配位的Aβ4-16的 partial charges 是使用限制静电势（RESP）方案基于Gaussian16的量子力学计算得出的，随后使用Antechamber进行电荷拟合。使用LINCS和SETTLE算法应用键约束，并应用2 fs的积分时间步长。将系统平衡并热化至300 K，随后在等温等压（NPT）系综下进行每次100 ns的生产MD运行。使用粒子网格Ewald（PME）处理长程静电相互作用，并使用Parrinello–Rahman气压计和速度重标度热浴耦合分别维持压力和温度。周期性边界条件复制了元胞。通过施加在肽质心上的谐波约束（力常数 = 1000 kJ/mol/nm2），将肽从水相缓慢拉向界面。关于模拟协议和数据分析的更多信息在支持信息中提供。
结果与讨论
Aβ肽在水/DCE界面
首先，以BATPBCl作为有机相电解质（电池I），研究了Aβ1-16在水/DCE界面的相互作用。图1A中的CV显示正向扫描中有一个明显的信号，半波电位为0.14 V，反向扫描中在0.08 V处有一个峰。两个信号的最大电流与扫描速率呈线性关系（图1B），表明电荷转移过程之前带电物种在界面处的积累。在负伽尔瓦尼电位下未观察到变化，表明肽每个周期都从ITIES完全解吸。这与下面的MD模拟结果一致，表明相互作用主要是静电作用。图1C显示了不存在（黑色）和存在（红色/橙色）5 μM Aβ1-16时界面的微分电容。在存在离子吸附的情况下，界面介电层的电荷增加，导致电容电流增加。Hartvig等人发表了对ITIES处蛋白质吸附微分电容的理论研究，评估了不同参数（例如蛋白质的电荷或相的介电常数）对电容图的影响。电容曲线中的最小值代表零电荷电位（pzc）。可以观察到pzc向伽尔瓦尼标度上更负的电位移动，并向更高的电容值移动（图1C）。电容的增加是由于界面处带电物种浓度增加，而向负电位移动表明带正电物种的吸附。随着电位增加，电容增加，直到在0.14 V左右达到平台（图1C中的橙色虚线）。从正到负电位扫描的微分电容显示出相同的趋势（图1C中的红色虚线）；然而，可以观察到正向和反向扫描之间存在滞后现象。Sakae等人也展示了从正到负电位或反之扫描时微分电容的差异。他们得出结论，对于相反的扫描方向，“界面反应物种”是不同的。这可能由分析物取向、聚集或界面张力的变化引起。然而，图1C中pzc的移动是可重复且时间无关的，这通过从电位窗口两侧开始的扫描得到证实，排除了肽在ITIES吸附时降解或发生不可逆修饰的可能性。通过在5 μM Aβ1-16恒定浓度下重复CV扫描超过4小时进行的稳定性测试显示偏差极小，加强了肽界面吸附的可逆和稳定性质。
为了进一步检查有机抗衡离子的影响，用BATB替换BATPBCl，将有机阴离子从TPBCl–（电池I）改为TB–（电池II）。这些离子在芳香环上的取代基不同（见方案2）：TPBCl–含有对位氯基团，而TB–具有吸电子的氟化基团，导致增强的电荷离域和界面处改变的静电相互作用。它们的疏水性差异很小，使得观察到的效应主要归因于阴离子与肽在界面处的静电相互作用。图2A比较了存在TB–或TPBCl–作为有机阴离子时记录的背景校正CV。两个系统在可比较的伽尔瓦尼电位下在正向和反向扫描中都显示出清晰的信号，峰值电位差为20-30 mV。考虑到实验不确定性，仅基于CV难以解释这种偏移。微分电容图（图2B,C）显示两个系统在约20 μF/cm2处都有平台，并且与背景相比，在pzc处的电容增加，加入肽后向更负的电位移动——对于TPBCl–更为显著（图2B）。两条曲线在反向扫描方向都显示平台处微分电容下降，在存在TB–时正向和反向扫描之间的差异更为明显（图2C）。电容在反向扫描方向在0.08 V（TPBCl–）相比0.13 V（TB–）下降，表明吸附层或界面介电层在存在TPBCl–时通常更稳定。TPBCl–系统中pzc更负的移动表明界面处带正电物种的积累增强。这可能是由于TB–比TPBCl–吸附更强，或者是改变的肽取向，可能由TB–与Aβ1-16的离子配对介导，导致与TPBCl–系统相比pzc移动减小。TPBCl–较大的横向尺寸可能限制有机相中负电荷的积累，减少界面处的静电吸引，并总体上增加界面处的正净电荷，这导致观察到的pzc负移。对于TB–和TPBCl–，我们都观察到在电化学窗口正极末端有机阴离子的转移显著增加，相比没有肽的测量。这强烈表明肽在ITIES的存在辅助了有机阴离子的转移，正如Herzog等人对血红蛋白所观察到的那样。
当Aβ肽从Aβ1-16变为Aβ4-16时，CV正向扫描方向出现可比的吸附信号（图3A）。然而，反向扫描揭示解吸峰移动到0.22 V（Aβ4-16），而Aβ1-16为0.13 V（见图1和图2），表明界面相互作用发生改变。正向和反向扫描中的两个信号都显示电流随扫描速率增加而增加。在20 mV/s扫描速率下仔细检查（图3C插图）揭示了在0.30 V处有一个额外的信号，该信号在更低肽浓度（2.5 μM Aβ4-16，图3D）下变得更加明显。值得注意的是，0.30 V处的这个额外信号不随扫描速率增加（对比肽吸附引起的电容电流线性增加趋势）。0.3 V处峰的起源尚不清楚。它可能源于吸附肽的某些构象重排（见图S5B），改变了界面电荷密度和Aβ4-16与TB–离子之间的相互作用，如同Scanlon等人观察到的“前峰”情况。然而，与扫描速率无关的电流难以解释。随着肽浓度和扫描速率增加，吸附驱动的电容电流占主导地位，掩盖了这个峰。0.20 V处的解吸峰在对数标度上显示斜率为0.79，因此电流同时依赖于扩散和吸附（图S10B）。图3D插图显示最大负峰值电流的电位从0.24 V移动到0.19 V，随着扫描速率增加（另见图S10）。存在Aβ4-16时的微分电容（图3B）在0.25 V处显示一个尖锐的峰（正向扫描，浅绿色），而Aβ1-16则观察到一个宽的肩峰（见图1和图2）。根据Hartvig等人的研究，这表明Aβ4-16具有高吸附能。在负伽尔瓦尼电位下，Aβ4-16的电容在两个扫描方向都恢复到空白条件，证实了肽的完全解吸和可逆结合。AC伏安法中两个扫描方向之间的滞后仅限于正电位。有趣的是，尽管Aβ4-16带有更高的净正电荷（这通常会暗示比Aβ1-16更强的负移），但pzc的移动很小。这可能源于界面处的离子配对效应。分子内电荷的分布对于肽与液/液界面的相互作用可能高度相关。两种肽的差异可见于N末端位点，Aβ4-16在Phe4-Arg5-His6位置具有高局部化的正电荷，而Aβ1-16在Asp1和Glu3处有额外的负电荷（见方案1）。Aβ4-16缺乏这些负电基团导致与TB–更强的界面离子-离子相互作用（如下所示）。因此，Aβ4-16增强的界面相互作用和增加的吸附能最终导致微分电容的获得的变化。准确解释电化学结果需要识别Aβ肽与界面或有机电解质之间的活性相互作用。
为了理解极化液|液界面处肽-离子相互作用的分子决定因素，我们在正伽尔瓦尼电位下，对水|DCE界面处存在疏水离子的Aβ1–16和Aβ4–16进行了分子动力学（MD）模拟（图4和图S4；模拟设置见支持信息）。在相互作用能时间线中，更负的值对应于更强的TB––肽吸引力，而较不负或波动的值表明较弱或瞬时的相互作用。在每残基结合能图中，有利的贡献来自带正电残基（稳定TB–结合），而酸性残基贡献排斥（不利于TB–结合）。两种肽都稳定地定位于界面，并在轨迹的最后20 ns内保持界面取向（模拟收敛见图S5C-F）。在三个独立的100 ns重复中，TB–始终在两种肽的界面处积累，但对于Aβ4-16，积累明显更强、更密集（图4B,D和图S6D-F）。在Aβ4-16的相同界面区域观察到的BA+密度峰反映了一个次级效应——对浓缩的TB–层的静电响应，而不是直接的肽-阳离子相互作用。相比之下，对于Aβ1-16，BA+/TB–对大部分保留在体相DCE中，并且仅在孤立的重复中看到BA+的微量界面痕迹（图S6A-C,G-I）。这些结果证实，BA+和TB–显著的界面共积累是Aβ4-16系统独有的可重复特征（图S6），与其更强的界面结合倾向一致。
为了探究TB–的稳定作用，我们分析了残基水平的非共价相互作用能（静电+范德华力）和结合自由能分量（图4E-G和图S5G,H）。Aβ4-16的总结合自由能（ΔGbind）比Aβ1-16有利得多，主要由静电作用驱动。微小的范德华力和非极性溶剂化项贡献了稳定效应，而极性溶剂化施加了轻微的惩罚。残基水平分解（ΔGcontrib）揭示，在Aβ4-16中，残基Phe4, Arg5, His6, His13, His14和Lys16强烈有利于TB–结合，而Asp7和Glu11贡献排斥。相比之下，Aβ1-16保留了相同的有利残基，但额外包含了三个酸性末端（Glu3, Asp7, Glu11），其累积的静电惩罚降低了整体亲和力。Aβ4-16中缺乏Glu3因此消除了一个关键的排斥位点，解释了其增强的TB–吸引力和界面稳定性。MM/PBSA衍生的自由能差（ΔΔGspecificity≈ ?1100 kJ mol–1）进一步支持了TB–与Aβ4-16的优先结合，熵贡献可忽略。
Aβ–Cu(II)配合物与改变的界面相互作用
根据文献，Aβ1-16通过Asp1, His6, His13/His14和羧酸盐（3N模式）配位Cu(II)（见方案1），而Aβ4-16形成ATCUN（氨基末端铜和镍）基序，通过N末端残基Phe4, Arg5和His6结合Cu(II)（见方案1）。两种Aβ肽的CV在Cu(II)络合后显示出重大变化（图5）。对于Aβ1-16–Cu(II)，0.13 V处的解吸峰减弱（图5A，蓝色CV），而电容电流保持升高。pzc向更负的伽尔瓦尼电位移动（图5B，蓝色曲线）。对于Aβ4-16–Cu(II)，CV显示0.22 V和0.35 V处的峰消失（图5C）。微分电容中0.20 V处的峰（图5D中的绿色虚线）在反向扫描中被一个宽的肩峰取代。负扫描方向CV的强烈变化（图5C）支持了先前的假设，即主要的Aβ4-16-TB–离子相互作用位于肽的N末端位点。0.22 V处的峰（图3A和图5C）可能与强烈的界面离子对形成有关，而不是纯粹的解吸过程。负扫描方向0.35 V处的信号源于TB–离子从水相返回到有机相的转移。当Aβ4-16–Cu(II)配合物形成时，这个峰减弱，再次表明它与离子辅助的TB–转移有关，这里很可能是由吸附在液/液界面的游离肽的N末端位点促进的。微分电容的变化在Aβ4-16和Aβ4-16–Cu(II)之间比在Aβ1-16之间更为显著。由于相同的氨基酸既贡献于TB–结合（图4），又贡献于具有ATCUN基序中明确配位的Aβ4-16–Cu(II)络合，因此下文详细研究了Aβ4-16
