《Neurology Genetics》：Immune Cell Mitochondrial Phenotypes Are Largely Preserved in Mitochondrial Diseases and Do Not Reflect Disease Severity
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本研究通过分析37例线粒体疾病（MitoD）患者和68名健康对照的免疫细胞线粒体表型，发现不同免疫细胞类型（单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、血小板等）具有独特的线粒体氧化磷酸化（OxPhos）特征，这些特征在MitoD中基本保留，且与疾病严重程度无显著相关性。研究首次系统揭示了免疫细胞线粒体生物学在MitoD中的稳定性，为临床诊断提供了重要参考依据。
免疫细胞亚型具有独特的氧化磷酸化能力和线粒体含量
研究团队首先通过对比健康对照组不同免疫细胞类型的线粒体生物学特征，发现中性粒细胞表现出最低的线粒体含量（通过柠檬酸合酶（CS）活性和mtDNA拷贝数（mtDNAcn）评估）和氧化磷酸化（OxPhos）酶活性，其数值持续低于单核细胞和混合外周血单个核细胞（PBMCs）的一半。中性粒细胞的mtDNAcn平均值仅为56.6拷贝/细胞，而淋巴细胞则显示最高的mtDNAcn（平均177.7拷贝/细胞）。综合线粒体呼吸链容量指标——线粒体呼吸容量（MRC）在PBMCs中最高（MRC=107），比单核细胞（101.7）高5.2%，比淋巴细胞（84.6）高26.5%，比中性粒细胞（61.9）高72.9%，这确立了主要免疫细胞类型中线粒体OxPhos专业化的光谱。
研究人员进一步评估了同一细胞类型内不同线粒体特征之间的相关性。正如预期，由于PBMCs中的大多数细胞是淋巴细胞，线粒体特征在PBMCs和淋巴细胞内倾向于良好相关（平均r值分别为0.59和0.56）。而单核细胞、中性粒细胞和血小板则未显示出线粒体特征间的强相关性（平均r值分别为0.31、0.06和0.06），表明这些特征在这些细胞类型中可能相对独立地受到调控。在同一个体的不同细胞类型之间，除中性粒细胞与PBMCs之间的CS活性（r=0.36, p=0.045）以及中性粒细胞与淋巴细胞之间的MRC（r=0.36, p=0.04）存在弱相关性外，未发现线粒体特征之间存在关联的证据。然而，经过多重比较校正后，这些相关性不再显著（Bonferroni校正后p值分别为0.68和0.60）。因此，某个细胞类型中线粒体含量或OxPhos活性高的个体，在其他细胞类型中并不一定具有同样高的线粒体特征，这与之前的发现一致。
免疫细胞类型呈现不同的线粒体型
为了进一步检查免疫细胞类型和PBMCs之间线粒体呼吸容量和含量的差异，研究人员创建了线粒体特征对的二元图。这些图区分了不同的线粒体表型（或称线粒体型），并允许我们在一个简单的二元线粒体型空间中将不同细胞类型彼此定位。这些线粒体型也可以以比率的形式呈现，其中具有相同比率的细胞类型沿对角线排列，从而可以量化和统计比较细胞类型之间的线粒体型谱。
研究人员首先检查了复合体IV活性相对于柠檬酸合酶的比率（CIV/CS比率）。大多数细胞类型显示出相似的CIV/CS比率，这体现在它们在CS与CIV活性二元图中沿相同的y/x线排列，并且大多数细胞类型的CIV/CS活性比率相似（介于0.053和0.064之间）。其他二元线粒体型图揭示了细胞类型之间显著更大的差异。例如，对于反映OxPhos复合体II（完全由核DNA（nDNA）基因编码）活性相对于复合体I（由mtDNA和nDNA共同编码）活性的CII/CI线粒体型，淋巴细胞显示出较低的CI活性（0.52 mmol/min/10? cells）但较高的CII活性（3.87 mmol/min/10? cells），导致较大的CII/CI比率（12.4）。这使得淋巴细胞位于线粒体型图的左上象限，而单核细胞则显示出相反的模式，其CII活性（2.27 mmol/min/10? cells）相对于较高的CI活性（2.66 mmol/min/10? cells）较低，比率为2.1，位于线粒体型图的右下象限。中性粒细胞显示出较低的CI活性（0.66 mmol/min/10? cells）和较低的CII活性（0.42 mmol/min/10? cells），平均CII/CI比率较低（0.86），线粒体型位置在左下象限。免疫细胞类型在其CS/mtDNAcn线粒体型（反映每单位CS或克雷布斯循环定义的线粒体的mtDNA含量）上也存在显著差异。这些结果共同强化了不同免疫细胞类型具有独特线粒体特性和呼吸容量的观点。
线粒体氧化磷酸化能力和含量在线粒体疾病中未受影响
接下来，研究人员比较了MitoD组和对照组在每种特定免疫细胞类型中的线粒体特征。在所有细胞类型和线粒体呼吸容量测量中，大多数差异很小（平均变化11.7%）且不显著。对照组和MitoD组之间唯一的显著差异是m.3243A>G组单核细胞中的CIV活性高出32%（p=0.02，Hedge's g=0.82）。单核细胞中nDNA编码的CII活性在MitoD组中也倾向于比对照组高51%至65%，这与两个MitoD亚组中存在的补偿性上调一致。跨细胞类型，MitoD患者和对照组之间的MRC没有差异。
与线粒体疾病的生物学特性一致，单核细胞中mtDNA编码的CI活性在MitoD患者中倾向于低22%至36%，而核DNA编码的CII活性则高出51%至65%。这些差异显示出中等至较大的效应大小（Hedge's g=0.41–0.86），并且MitoD组的CII/CI活性比率比对照组高86%（p=0.017，Hedge's g=0.66）。这些趋势在其他细胞类型中未发现，并且由于个体间差异较大，单个酶测量指标在组间均无显著差异。
总体而言，与免疫细胞亚型之间的差异相比，对照组和MitoD组之间线粒体特征的差异很小，并且在对照组中观察到的细胞类型之间的比率显著差异在MitoD组中得以保留。细胞类型之间的差异在MitoD中也得以保留，表明细胞类型特异性的线粒体表型在很大程度上不受线粒体疾病的影响。
线粒体氧化磷酸化能力与线粒体疾病严重程度不相关
研究人员进一步探究了白细胞线粒体呼吸容量是否与MitoD生物标志物和症状严重程度相关。总体而言，线粒体特征与线粒体疾病的循环生物标志物（如生长分化因子15（GDF15）和成纤维细胞生长因子21（FGF21））仅呈弱相关。与症状严重程度和功能能力的临床测量指标也显示出类似模式，仅存在弱且不显著的相关性（r绝对值=0.10–0.17）。
在所有细胞类型和血小板中，血小板线粒体与临床指标的相关性最强，而淋巴细胞的相关性最弱。线粒体特征与疾病严重程度测量指标之间的相关性在NMDAS上最强，但总体较弱（r绝对值平均=0.13–0.23）。在线粒体特征中，与CI活性的相关性最强，这与MitoD影响mtDNA编码的复合体一致，但总体也较弱（r绝对值平均=0.17–0.21）。MRC与疾病严重程度缺乏相关性，这与免疫细胞MRC在MitoD和对照组之间缺乏差异的结果一致。
MitoD组和对照组中线粒体生物学随时间的変化
为了评估线粒体特征在不同状态和一天中不同时间的稳定性，研究人员最终评估了上午/空腹状态（时间点1）和应激后下午/进食状态（时间点2）之间免疫线粒体生物学的变化。在健康对照组中，CI和CII活性、mtDNAcn和MRC从时间点1到时间点2发生了显著变化（变化4%至25%，p<0.048）。在MitoD组中观察到类似的变化，尽管只有mtDNAcn从时间点1到时间点2的增加是显著的（增加16%，p=0.0039）。然而，CI活性在MitoD组中表现出相反的变化方向，患者中呈现13%的上午至下午下降，而健康对照组则表现出显著的17%升高（p=0.028）。
研究人员还检查了PBMC线粒体特征的这些变化是否由细胞类型组成的动态变化所驱动。白细胞类型（淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）的比例从时间点1到时间点2显示出几个显著变化（变化范围5%至13%，p<0.0061），涉及除健康对照组单核细胞外的所有细胞类型。MitoD患者显示出类似的变化（变化2%至18%，显著p=0.0003–0.02），表明免疫生物学的总体时间/昼夜节律变化在MitoD中未受影响。
在对照组和MitoD组中，细胞类型丰度的变化在很大程度上不能解释观察到的线粒体生物学变化（平均r=0.04）。一个例外是MitoD组中单核细胞百分比变化与单核细胞CS活性变化之间存在显著相关性（r=0.55, p=0.015；Bonferroni校正后p=0.45），而这在健康对照组中未观察到。需要进一步的工作来理解可能解释线粒体OxPhos酶活性和mtDNAcn水平时间变化的因素及其与线粒体疾病免疫方面的潜在相关性。
讨论
本研究报告了在数十名具有分子定义mtDNA缺陷导致MitoD的个体中，对免疫细胞亚型、PBMCs和血小板的OxPhos酶活性和线粒体含量标志物进行了分析。我们的结果证实了先前显示免疫细胞亚型具有独特线粒体谱的工作，并证明这些谱受MitoD中mtDNA缺陷的影响极小。因此，免疫细胞类型特异性的线粒体表型在MitoD中得以保留，但与MitoD生物标志物或症状严重程度并不一致相关，并且其线粒体表型的时间变异在MitoD中仅受到极小影响或完全不受影响。总之，这项工作强调了这样一个观点：免疫线粒体生物学，尽管可以通过微创采血方便地获取，并不能反映MitoD中导致临床体征和症状的全身性线粒体OxPhos缺陷的严重程度。
本研究报告的独特的细胞类型特异性线粒体表型与之前的报告相似。中性粒细胞的线粒体特征在所有测量指标上 consistently 较低，这与先前证明其主要作用不是ATP合成的工作一致，而单核细胞和PBMCs在所有变量上也显示出 consistently 较高的测量值。
尽管预计m.3243A>G和单一大尺度缺失都会影响OxPhos复合体基因表达和蛋白质合成，但我们注意到MitoD参与者和健康对照组之间的线粒体OxPhos谱缺乏差异。这一结果与免疫细胞中存在纯化选择一致，这显著降低了这些导致线粒体疾病的变异的异质性水平，使得单一大尺度mtDNA缺失通常无法检测到。免疫细胞中mtDNA缺陷的消除将最大限度地减少OxPhos生化缺陷。
与白细胞OxPhos容量缺乏组间差异一致，MRC与线粒体疾病生物标志物或症状并不 consistently 相关。这些相关性在淋巴细胞中最弱，与淋巴样细胞显示纯化选择一致，导致跨免疫细胞的致病性变异负荷最低。相比之下，血小板与线粒体疾病标志物显示出最强和最显著的相关性。纯化选择尚未在血小板中得到广泛研究，但鉴于此处的结果，可能是血小板所来源的巨核细胞比其他免疫细胞类型经历的纯化选择更少。
虽然不显著，但单核细胞也表现出CI和CII活性的变化，这些变化与在骨骼肌和大脑中观察到的线粒体疾病病因学一致，平均CI活性有降低趋势，而CII平均活性有升高趋势。这些单核细胞特异性的变化支持了单核细胞和树突状细胞相对于淋巴样细胞的纯化选择水平较低。然而，需要进一步研究以确定这些变化是否显著以及为何局限于单核细胞。总体而言，鉴于免疫细胞OxPhos受线粒体疾病影响极小且与疾病严重程度不相关，我们可以预期免疫细胞线粒体谱不能准确代表MitoD中的体细胞（骨骼肌、大脑等）或全身OxPhos容量。
除了细胞类型依赖的线粒体特征差异外，我们的结果揭示了PBMC线粒体特征潜在的时间依赖性变化。这些变化无法用免疫细胞比例的变化来解释，这有些令人惊讶，因为先前已确定循环细胞类型比例与PBMC线粒体特征之间存在关联。然而，除了时间因素外，此处还有其他因素可能影响了这两个样本之间的线粒体表型——包括空腹状态和执行压力性社会评价演讲任务。在之前的工作中，我们发现线粒体OxPhos容量中高达10%至15%的变异与主观报告的积极和消极情绪（例如，感到精力充沛和有爱心）相关。因此，在下午（时间点2）PBMC样本采集前约2小时发生的短暂（5分钟）心理社会应激源，往往会引发压力和负面情绪，可能导致了上午/应激前和下午/应激后时间点之间观察到的OxPhos谱的部分差异。这两个PBMC样本中多个变量同时发生变化，不幸地限制了对其线粒体特征在上午和下午时间点之间任何差异进行解释的程度。为了梳理这些潜在因素，未来的工作需要评估上午和下午样本的线粒体参数，并在有控制和无控制应激暴露的情况下进行。免疫细胞中线粒体呼吸容量变化的原因和后果是否反映其他器官的变化，也将是一个需要检查的重要问题。未来研究中还应考虑线粒体生物学中潜在的时间依赖性变化，既包括小时/分钟尺度的时间变化，也包括在疾病进展过程中进行更多重复测量的纵向研究。
本研究的局限性包括跨细胞类型的可变样本量。由于样本收集限制，某些细胞亚型的样本量和细胞计数有限。这限制了一些相关性分析的样本量，特别是我们有限的MitoD人群，同时也给我们的酶活性测定引入了一些噪音。考虑到观察到的方差，增加所有组的样本量自然会加强这项研究。此外，虽然我们证明免疫细胞线粒体在MitoD中受影响极小，但这种效应的分子基础仍不清楚。骨髓中低异质性细胞的纯化选择可能起作用。本研究的一个主要局限性是缺乏每种免疫细胞类型的异质性测量，如果能与功能测定一起进行，将有助于确定这种效应在多大程度上归因于致病性变异负荷或其他非遗传的体液因素。将这些免疫结果与另一个不易受纯化选择影响的组织中的线粒体特征进行比较也将很有价值。然而，即使存在mtDNA异质性，MitoD患者特定（亚）群免疫细胞中的补偿机制也可能在一定程度上减轻mtDNA致病性变异对OxPhos酶活性和线粒体含量标志物的影响。最后，我们注意到我们的MitoD患者人群仅限于具有m.3243A>G致病性变异和单一大尺度缺失致病性变异的个体。这些免疫细胞线粒体表型可能不适用于所有线粒体疾病，特别是核DNA变异，其中不可能发生mtDNA纯化选择，需要进一步的工作来定义跨线粒体疾病谱系的免疫细胞线粒体型。
总体而言，本研究提供了关于MitoD患者和健康对照组免疫细胞特异性和时间依赖性PBMC线粒体OxPhos谱的见解。总之，在多种白细胞细胞类型中进行的多变量酶学和分子分析扩展了我们对MitoD中免疫线粒体生物学的理解。虽然免疫线粒体受mtDNA致病性变异的影响极小，并且不太可能反映MitoD的严重程度或提供可靠的诊断和/或预后信息，但免疫线粒体仍可能为了解疾病修饰因素如何影响跨器官系统的线粒体生物学提供一个窗口。
