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本研究针对弗里德赖希共济失调(FRDA)中frataxin(FXN)蛋白功能缺失的问题，开发了特异性靶向人源FXN的纳米抗体(NBs)。研究人员通过噬菌体展示筛选获得多种FXN特异性NBs，系统评估了它们对半胱氨酸脱硫酶活性的调控作用及与FXN的相互作用机制。研究发现NBs能在体外稳定野生型和FRDA相关FXN变体，并通过NMR、SAXS和X射线晶体学揭示了复合物的高分辨率结构。细胞实验证实NBs能定位于线粒体基质并与FXN直接相互作用，且不影响细胞代谢关键指标。该研究为开发FRDA的新型治疗策略提供了重要工具和理论基础。
铁硫(Fe-S)簇作为重要的辅因子，在细胞的能量代谢、DNA修复和基因表达调控等关键生命过程中发挥着不可替代的作用。在真核细胞中，大多数Fe-S簇的生物合成发生在线粒体内，这一复杂过程需要多个蛋白质协同完成，其中frataxin(FXN)蛋白作为半胱氨酸脱硫酶超复合物的激活剂尤为关键。然而，当FXN蛋白的表达或功能出现异常时，就会引发一种罕见的遗传性神经退行性疾病——弗里德赖希共济失调(FRDA)。这种疾病影响着约五万分之一的人群，患者常表现为进行性的运动协调障碍、心肌病变等严重症状，目前尚无有效的根治方法。
在FRDA患者中，约95%的病例是由于FXN基因第一内含子中GAA三核苷酸重复序列异常扩增导致基因转录受抑制，其余5-6%的患者则携带FXN基因的点突变。这些突变可能影响FXN蛋白的稳定性、细胞内定位、加工过程或其与Fe-S簇组装超复合物中其他组分的相互作用能力。因此，寻找能够特异性识别并结合FXN的小分子工具，不仅有助于深入理解FXN的生物学功能，还可能为开发FRDA的治疗策略提供新思路。
近年来，源于骆驼科动物重链抗体的纳米抗体(NBs)因其分子量小(约15kDa)、稳定性高、易于表达和改造等优势，在生物医学研究中的应用日益广泛。与传统抗体相比，NBs具有更好的组织穿透能力，且免疫原性较低，可通过人源化改造进一步降低，使其成为治疗应用的理想候选分子。目前，多种基于NBs的神经退行性疾病和癌症治疗策略已进入临床研发阶段。
在此背景下，研究人员在《Communications Biology》上发表了题为"Nanobodies as tools for studying human frataxin biology"的研究论文，系统探索了纳米抗体作为研究人源frataxin生物学功能的新型工具。该研究旨在开发能够特异性结合FXN的NBs，评估它们对FXN功能的影响，并探究其在细胞环境中的应用潜力，为FRDA的机制研究和治疗开发提供新的视角和方法。
本研究主要采用了以下关键技术方法：通过噬菌体展示技术筛选特异性靶向人FXN的纳米抗体；利用尺寸排阻色谱(SEC)和生物层干涉技术(BLI)分析NB与FXN的相互作用；通过核磁共振(NMR)、小角X射线散射(SAXS)和X射线晶体学解析NB-FXN复合物的三维结构；采用细胞转染、免疫荧光、邻近连接 assay(PLA)和免疫共沉淀技术在HeLa Kyoto和HEK-293T细胞模型中评估NBs的亚细胞定位及与FXN的相互作用；使用Seahorse能量代谢分析仪测定细胞氧消耗率(OCR)，评估NBs表达对线粒体功能的影响。
序列分析和结构预测
研究人员通过噬菌体展示技术筛选获得了30种特异性针对人源FXN的纳米抗体，经序列分析确定了16种不同的序列。通过AlphaFold3对NB-FXN复合物进行结构预测，结果显示不同的NBs可能与FXN形成多种类型的复合物。预测表明，某些NBs可能通过占据FXN与超复合物中其他组分(如ISCU2或NFS1)相互作用的表面而产生抑制效应，而另一些NBs则可能结合于不影响FXN功能的区域。
NB在大肠杆菌中的表达
选定的NBs在大肠杆菌WK6菌株中成功表达并纯化，获得纯度达95%的蛋白质，产量为5-15 mg/L。尺寸排阻色谱分析证实所有NBs均以单体形式存在。除NB_28F6在4°C储存时出现蛋白降解外，其余NBs的分子量均与预期值高度一致。
NB对超复合物活性的体外影响
研究人员评估了NBs对L-半胱氨酸脱硫酶催化活性的影响。结果显示，NB_4A7和NB_16C10对酶活性的抑制程度较低至中等，而NB_6B1和NB_28F6则表现出较强的抑制效果。值得注意的是，高浓度的NB_6B1和NB_28F6使超复合物活性降至接近无FXN时的水平，而NB_16C10即使在较高浓度下也仅产生部分抑制，表明它可能影响超复合物的构象或拓扑结构，但不完全阻断FXN与超复合物的相互作用。特别值得关注的是，NB_4A7即使在较高浓度下也仅产生轻微抑制，提示在该NB存在下仍能形成有活性的超复合物。
NB-FXN相互作用的体外表征
通过尺寸排阻色谱证实了NB与FXN能够形成稳定的复合物，且解离平衡较慢。生物层干涉实验进一步表明，NBs与FXN的结合亲和力极高，平衡解离常数(KD)在纳摩尔范围(1-33 nM)，结合和解离动力学速率常数分别为10^5 M^-1s^-1和10^-4 s^-1量级。
NB在FXN表面结合位点的鉴定
通过核磁共振化学位移扰动(CSP)分析，在氨基酸残基水平上确定了NBs的结合位点。结果显示，NB_4A7、NB_6B1和NB_16C10结合于FXN表面的相似区域，而NB_28F6则采用不同的结合模式。所有NBs与FXN的结合均表现为慢交换机制，且FXN核心区域的一些残基(如Phe110、Tyr123、Phe127和Leu113)表现出显著的CSP，表明NB与FXN的相互作用可能调整了FXN结构的某些构象细节。
NB相互作用对FXN构象稳定性的调控
通过温度诱导的变性实验，研究人员评估了NBs对FXN构象稳定性的影响。以高度不稳定的FRDA相关变体FXN G130V为探针，发现NBs能够显著稳定该变体，使其变性温度(Tm)提高至少15°C。例如，G130V变体与NB_4A7复合物的Tm值分别为51.8±0.3°C和70.1±0.1°C，甚至高于野生型FXN的Tm值(65.9±0.3°C)。圆二色谱分析进一步验证了这一稳定效果。
NB_4A7还能稳定其他不稳定的FRDA相关变体，如W155R和L198R(△Tm分别为14°C和17°C)。然而，对于D122Y和G137V变体，NB_4A7的稳定效果较弱，而NB_28F6则能有效稳定这些变体。
NB-FXN复合物的三维结构
通过X射线晶体学解析了NB_4A7、NB_6B1和NB16C10与野生型FXN(90-210变体)复合物的高分辨率结构(分辨率分别为1.25 ?、1.48 ?和2.0 ?)。结构分析显示，FXN与NBs以T型方式排列，FXN的酸性脊(连接α1和β1的环，残基Glu114-Glu122)、β2-β3环(残基135-139)和α1螺旋的顶端与NBβ-夹心结构的中心部分相对。NBs主要通过β3-β4环(残基Arg38-His46)、β4链(残基Leu47-Arg50)和β5-β6环(残基Asp61-Lys64)与FXN相互作用。值得注意的是，NBs的互补决定区(CDR)并不直接参与与FXN的结合。
溶液中复合物的SAXS研究
对未能获得晶体的FXN:NB_28F6复合物进行小角X射线散射分析，结果显示该复合物中两个蛋白质以平行方式排列，各自的β-片层构成一个延长的β-片层结构，这与AlphaFold3的预测一致。这种不同的排列方式可能解释了NB_28F6在细胞实验中观察到的独特行为。
NB-FXN复合物与超复合物的对接
将晶体学获得的NB-FXN复合物与先前通过冷冻电镜解析的超复合物结构进行对接分析，发现I型结合的NBs(NB_4A7、NB_6B1和NB_16C10)与超复合物其他组分之间仅存在轻微的空间冲突，而NB_28F6的结合则可能直接抑制FXN与超复合物的相互作用。通过尺寸排阻色谱和干涉实验证实，NB_4A7能够在超复合物存在下与FXN结合，且不阻碍超复合物的形成。
NB在人类细胞系线粒体中的表达
在HeLa Kyoto细胞中表达带有柠檬酸合酶线粒体靶向序列(MTS)的NBs，免疫荧光实验证实NBs定位于线粒体基质。表达NB_4A7、NB_6B1和NB_16C10不影响细胞活力，而NB_28F6的表达水平显著低于其他NBs。
NB表达及与FXN在细胞中的相互作用
共表达NB_4A7和FXN前体蛋白(210个残基)的实验显示两种蛋白质在同一亚细胞区室共定位。邻近连接 assay进一步证实FXN与NB在细胞内处于直接接触状态(距离小于40 nm)。免疫共聚实验表明，NB_16C10能够与内源性FXN形成稳定复合物。质谱分析结果也支持这一结论。
NB表达对Fe-S簇相关酶活性和细胞代谢的影响
在HEK-293T细胞中表达NBs后，评估了对Fe-S簇依赖性酶(乌头酸酶ACO和琥珀酸脱氢酶SDH)活性的影响。结果显示，NB_4A7、NB_6B1和NB_16C10的表达仅轻微调节ACO和SDH活性，而NB_28F6的表达水平较低，难以准确评估其效应。通过Seahorse分析仪测定氧消耗率(OCR)发现，表达NB_6B1或16C10的细胞OCR未发生改变，而NB_4A7表达导致基础呼吸能力轻微下降，NB_28F6则引起基础和最大呼吸能力降低，提示线粒体代谢受损。
本研究成功开发了多种特异性靶向人源FXN的纳米抗体，系统表征了它们与FXN的相互作用机制及其对FXN功能的影响。研究发现这些NBs与FXN以高亲和力(KD为1-33 nM)结合，并表现出慢解离动力学特性。通过多种结构生物学技术(NMR、X射线晶体学和SAXS)，研究人员揭示了两种不同的结合模式：I型结合(NB_4A7、NB_6B1和NB_16C10)和II型结合(NB_28F6)。特别重要的是，NBs能够在体外显著稳定多种FRDA相关的FXN变体，提高其热稳定性。
在细胞模型中，研究人员证实NBs能够成功定位到线粒体基质，并与FXN发生直接相互作用。令人鼓舞的是，大多数NBs的表达不影响关键代谢参数，如Fe-S簇依赖性酶活性和线粒体呼吸功能，表明NBs与FXN的结合并未破坏Fe-S簇组装通路的核心功能。然而，NB_28F6的表现与其他NBs有所不同，即使表达水平较低，也能引起线粒体代谢指标的改变，这可能与其独特的结合模式有关。
该研究的创新性在于首次将纳米抗体技术应用于FXN生物学研究，为探索FRDA的发病机制和开发新型治疗策略提供了有力工具。这些特异性NBs不仅可用于研究FXN在生理和病理条件下的功能调控，还可能为开发基于稳定FXN构象的治疗方法奠定基础。未来研究可进一步优化NBs的性质，评估它们在疾病模型中的治疗潜力，并探索其作为靶向递送工具的可行性。
总之，这项工作展示了纳米抗体作为分子工具在线粒体蛋白质功能研究中的巨大潜力，为理解弗里德赖希共济失调的分子机制和开发治疗策略开辟了新途径。通过精确调控FXN的稳定性和功能，这些新型工具可能为其他与蛋白质稳定性相关的疾病研究提供借鉴。
