《Toxicology》：In vivo high-throughput toxicity screening of brominated flame retardants using a
Caenorhabditis elegans transcription factor RNAi platform
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溴化阻燃剂（BFRs）如TBBPA、HBCDD和DBDPE的环境持久性与神经毒性引发关注。本研究利用线虫（C. elegans）转录因子（TF）RNAi高通量筛选平台，发现44个TF调控TBBPA诱导的神经毒性行为，并通过Reactome和CTD数据库分析揭示视黄酸受体（RA）信号通路为核心机制，关联四个神经发育毒理AOPs。进一步验证HBCDD和DBDPE存在部分保守的分子及行为响应，证实该平台适用于跨化学品的机制评估，支持基于AOP的替代品安全评价和新一代风险评估框架。
作者：Siyeol Ahn、Elizabeth Dufourcq Sekatcheff、Jinhee Choi
韩国首尔大学环境工程学院，首尔市东大门区首尔西路163号，邮编02504
摘要
溴化阻燃剂（BFRs），如四溴双酚A（TBBPA）、六溴环十二烷（HBCDD）和十溴二苯乙烷（DBDPE），被广泛用于各种消费品中，包括电子产品、纺织品和家具。然而，它们的环境持久性和潜在的神经发育毒性引起了越来越多的关注。像TBBPA和HBCDD这样的传统化合物正在接受监管或被逐步淘汰，而像DBDPE这样的替代品仍然了解不足，这对其作为替代品的适用性存在不确定性。为了迅速填补这些数据匮乏的物质的认知空白，并避免遗憾的替代选择，我们建立了一个基于机制的高通量体内毒性筛选平台。我们使用RNA干扰（RNAi）技术对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的转录因子（TFs）进行了研究，以评估由BFR暴露引发的生物途径，从而评估其神经毒性（通过运动行为进行评估）。通过使用包含384个转录因子的RNAi文库，我们发现了44个调节TBBPA诱导的神经毒性的转录因子。通路分析（Reactome和CTD）表明视黄酸受体信号通路是一个关键事件，该通路与四个神经发育相关的重要过程（AOPs）相关联（AOP 520、523、532和533）。对sex-1和unc-55基因的表达分析证实了视黄酸信号通路的激活。将相同的方法应用于HBCDD和DBDPE，发现它们的行为和分子反应存在部分保守性，这支持了TBBPA相关AOP网络的跨化学物质适用性。这些发现证明了基于秀丽隐杆线虫的TF RNAi筛选方法作为机制毒理学新方法（NAM）的实用性。通过将分子起始事件与不良后果联系起来，这种策略能够在下一代风险评估（NGRA）框架内实现早期危害识别和跨化学物质的评估。
引言
溴化阻燃剂（BFRs）是一类广泛用于电子产品、纺织品、塑料和软垫家具等消费品中的化学物质，用于降低可燃性和延迟点火（De Wit, 2002; Lou et al., 2025; Zuiderveen et al., 2020）。虽然这些化合物提高了消防安全，但它们的广泛使用、持久性和生物累积性引发了人们对它们对人体健康和环境潜在不良影响的日益担忧（Li et al., 2024; Meng et al., 2025; Yu et al., 2016）。其中，四溴双酚A（TBBPA）是生产最广泛的BFRs之一，由于其致癌性、干扰内分泌的潜力以及持久性、生物累积性和毒性（PBT）特性，被归类为高度关注物质（SVHC）（Schrenk et al., 2024; Sunday et al., 2022）。同样，六溴环十二烷（HBCDD）因其生殖和环境影响而被全球限制使用，而像十溴二苯乙烷（DBDPE）这样的替代品尽管毒理学特性有限，仍继续被用于消费品中（Marques and Cairrao, 2023; Wang et al., 2023）。继续使用受监管和替代的BFRs，特别是那些安全性数据有限的化合物，增加了用另一种具有相似或未知毒性的化学物质替代的风险（Zuiderveen et al., 2020）。鉴于BFRs在家庭用品中的普遍存在以及人类可能长期暴露于低剂量的情况，迫切需要基于机制的预测方法来评估这些化合物（Bajard et al., 2019; Kim et al., 2024）。特别是TBBPA在地表水中的浓度可高达4,870 ng/L，在鱼肠道中的脂质重量中的浓度可达197,000 ng/g，而尽管受到监管限制，HBCDD在环境中仍然普遍存在，其浓度在污泥中可达29,604 μg/kg，在沉积物中可达7,800 ng/g（Hwang et al., 2012; Oh et al., 2014; Xiong et al., 2015; Yang et al., 2012; Yang et al., 2022）。尽管环境中的浓度可能较低，但机制毒理学研究通常使用更高的浓度来揭示内在的生物活性并为监管阈值提供依据。
传统的化学危害评估方法依赖于动物体内的实验，这可能耗时、成本高昂且伦理上具有挑战性（Council, 2007; Ouedraogo et al., 2025; Taylor, 2024）。这些限制，加上分子科学和计算科学的进步，推动了新方法（NAMs）的发展，这些方法利用分子和细胞水平的机制数据（Jeong et al., 2022; Jeong and Choi, 2022; Stucki et al., 2022）。尽管NAMs为预测毒理学提供了强大的工具，但将早期分子扰动与复杂的最终结果（如神经发育障碍）联系起来仍然是一个主要挑战（Carstens et al., 2022; Masjosthusmann et al., 2020）。这突显了需要能够将分子反应与表型结果联系起来的替代性全生物体模型，以加强NAMs在下一代风险评估（NGRA）中的应用（Huayta et al., 2025; Sammi et al., 2022）。
在这种背景下，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）越来越被认为是机制毒理学的有前途的体内替代模型（Barbosa et al., 2025; Huayta et al., 2025; Hunt, 2016; Hunt et al., 2020）。这种线虫具有多个优势，例如完全测序的基因组、与人类生物学相关的保守信号通路，以及适用于高通量筛选（Eom et al., 2014; M. A. Kim et al., 2019a; Kim et al., 2018）。大约60-80%的其基因在人类中也是保守的，因此秀丽隐杆线虫为研究发育和神经效应提供了生物学上有意义的模型（Kaletta and Hengartner, 2006）。
特别是，秀丽隐杆线虫的RNA干扰（RNAi）系统能够特异性、高效且高通量地敲低目标基因，为在基因水平上研究人类健康提供了强大的模型（Conte et al., 2015a）。这种方法已广泛应用于基因组规模的筛选研究中，以识别化学诱导毒性的关键调节因子，包括控制上游分子反应的转录因子（TFs），这些转录因子可以通过上调或下调基因表达来改变整个通路和生物过程。因此，TF RNAi是一种直接的方法，可以揭示特定物质的暴露是否会导致毒性加剧或缓解，以及哪些通路介导这些毒性反应（Kim et al., 2020a; Y. Kim et al., 2019a）。
我们之前在两项研究中展示了这种方法的应用性，这两项研究分别针对高度复杂或特性不明确的毒性物质。在第一项研究中，我们使用秀丽隐杆线虫的TF RNAi筛选来识别与HDPE微塑料诱导的毒性相关的分子起始事件，这些毒性事件涉及核苷酸切除修复和TGF-β信号通路（Y. Kim et al., 2019a）。在第二项研究中，我们整合了秀丽隐杆线虫、斑马鱼和人类队列的数据，以阐明河北精神油泄漏事件中核苷酸切除修复通路的激活情况。这些研究表明，秀丽隐杆线虫中的TF RNAi筛选是一个有效的平台，可以识别与不良结果通路（AOPs）相关的机制，即使对于毒性特征定义不清的复杂化学混合物或新兴污染物也是如此。AOP框架通过一系列关键事件（KEs）将分子起始事件（MIEs）与不良结果（AOs）联系起来，提供了一种无需依赖最终终点即可预测毒性机制的结构化方法（Ankley et al., 2010）。将AOPs纳入替代测试模型中可以增强机制数据的解释，并支持监管应用。基于这些发现，我们将这种基于机制的筛选策略应用于BFRs，这是一类常见于消费品的化学物质，旨在阐明其分子毒性通路并评估其监管相关性。
在本研究中，我们使用包含384个秀丽隐杆线虫转录因子的RNAi文库，进行了基于机制的高通量体内筛选，以研究TBBPA诱导的毒性背后的分子机制，其中184个转录因子是核激素受体。选择运动行为作为表型终点，因为这与秀丽隐杆线虫的神经毒性相关，并且适合定量筛选（Barbosa et al., 2025; Huayta et al., 2025; Hunt, 2016; Hunt et al., 2020）。在384个被RNAi处理的线虫中，有44个线虫被发现有调节TBBPA诱导的行为效应。随后使用Reactome和Comparative Toxicogenomics Database（CTD）进行的通路富集分析确定视黄酸受体信号通路是一个关键机制事件。该通路进一步与四个与神经发育结果相关的现有AOPs相对应。为了评估这一机制框架的更广泛相关性，我们将相同的筛选和验证方法应用于HBCDD和DBDPE。这两种化学物质显示出部分保守的分子和行为反应，表明在结构相关的BFRs中存在机制上的共性。
我们结合基于秀丽隐杆线虫的TF RNAi筛选和AOP解释的综合性方法旨在：（1）识别参与BFR诱导的神经毒性的转录调节因子；（2）揭示与不良结果相关的进化保守通路；（3）支持基于NAM的化学评估框架的发展。通过在一个透明的、基于AOP的结构中将早期分子事件与最终表型联系起来，本研究为NGRA做出了贡献，并提供了一种评估消费品中常用化学品安全性的实用策略。
秀丽隐杆线虫品系和培养
野生型Bristol N2和突变体rrf-3（pk1426）由明尼苏达大学秀丽隐杆线虫遗传中心提供。秀丽隐杆线虫在20°C下培养于E. coli OP50种子线虫生长培养基（NGM）琼脂板上，按照标准协议制备（Brenner, 1974）。在化学暴露之前，收集在NGM板上培养的怀孕成年线虫，并使用次氯酸盐溶液进行同步处理。
化学信息和制备
四溴双酚A（TBBPA，CAS编号79-94-7），六溴环十二烷
工作流程
本研究的工作流程如图1所示，旨在将高通量筛选与机制解释结合在一个AOP框架内。该方法包括三个连续步骤：（1）在秀丽隐杆线虫中进行TF RNAi筛选；（2）基于通路的分析和AOP对齐；（3）对结构相关的BFRs进行机制相关的跨物种比较。
在第一步中，我们对秀丽隐杆线虫中的384个转录因子进行了高通量RNAi筛选，以TBBPA作为目标化学物质。
结论
本研究展示了基于秀丽隐杆线虫的TF RNAi筛选平台作为高通量、基于机制的方法的实用性，用于识别由BFRs引发的AOP相关事件。以TBBPA作为模型毒物，我们识别了44个调节神经行为表型的转录因子，其中视黄酸信号通路被确定为关键机制轴。功能和转录验证证实了视黄酸信号通路的相关性，并将其映射到四个已建立的神经发育AOPs上。
未引用的参考文献
（报告指南，2017; Kim et al., 2019b, Kim et al., 2019a, van der Most et al., 2023）
CRediT作者贡献声明
Siyeol Ahn：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，方法学，正式分析，数据管理。Elizabeth Dufourcq Sekatcheff：撰写 – 原始草稿，监督，方法学，调查，正式分析，数据管理。Jinhee Choi：撰写 – 审稿与编辑，验证，监督，项目管理，方法学，概念化。
利益冲突声明
作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：Jinhee Choi报告称获得了韩国环境产业技术研究院的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了韩国环境产业技术研究院（KEITI）的支持，该研究通过“家用化学品安全管理技术开发项目”（RS-2023-00215309）获得环境部的资助。
作者声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
