《Molecular and Cellular Biology》：Cancer-Associated DAXX Mutations Reveal a Critical Role for ATRX Localization in ALT Suppression
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本综述系统阐述了DAXX基因突变通过影响ATRX/DAXX/H3.3组蛋白伴侣复合物的功能，在端粒替代延长（ALT）机制中的关键调控作用。研究首次证实DAXX介导的ATRX核定位（而非H3.3沉积）是抑制ALT的核心机制，为理解肿瘤（如骨肉瘤、胰腺神经内分泌肿瘤）的端粒维持机制提供了新视角。
癌症相关DAXX突变揭示ATRX核定位在ALT抑制中的关键作用
引言
在增殖细胞中，由于DNA末端复制问题，端粒随着每次细胞分裂而缩短。这种侵蚀被端粒酶所抵消，端粒酶利用RNA模板添加端粒重复序列。在10-15%的肿瘤中，端粒不是通过端粒酶延长，而是通过一种称为端粒替代延长（Alternative Lengthening of Telomeres, ALT）的DNA模板过程进行延长。ALT在间充质起源的肿瘤中更为常见，包括骨肉瘤，并且与ATRX/DAXX组蛋白H3.3伴侣复合物的突变相关。虽然ALT在骨肉瘤中与ATRX突变密切相关，但DAXX突变常见于胰腺神经内分泌肿瘤（Pancreatic Neuroendocrine Tumors, PanNETs）并与较差的预后相关。ATRX或DAXX的缺失通常被推测会导致ALT，但尚不清楚DAXX的错义突变是否会使细胞倾向于ALT端粒维持。本研究旨在更清晰地了解哪些疾病相关的DAXX错义突变可能赋予ALT表型，以及这些突变如何影响DAXX的功能。
DAXX具有多种细胞功能，可能参与ALT抑制。它最初被描述为凋亡细胞死亡的调节因子，尽管最初关于其与FAS相互作用的报告并未得到证实。DAXX对于胚胎发育至关重要——小鼠胚胎中Daxx的敲除会导致广泛的凋亡和胚胎致死性。DAXX还通过其与转录因子和染色质重塑因子的相互作用，共同调节众多靶基因的转录。最近，DAXX作为一种非经典的蛋白质折叠伴侣的功能被描述。在ALT的背景下，DAXX最常与其作为染色质重塑因子的活性相关。DAXX和SWI/SNF解旋酶ATRX协同作用，将非复制性组蛋白变体H3.3沉积在基因组的异染色质区域，包括端粒，而端粒处H3.3沉积的缺失通常被认为是ALT的基础。
DAXX的结构大部分是无序的，具有两个功能性的有序结构域。一个N端的四螺旋束（4-Helix Bundle, 4HB）为结合ATRX和其他相互作用因子提供了一个平台，而组蛋白结合域（Histone Binding Domain, HBD）则包裹着H3.3-H4异源二聚体。实际上，DAXX蛋白与H3.3-H4异源二聚体共同折叠，同时通过与H3.3特异性残基G90的接触确保对H3.3变体的特异性。DAXX的C端区域本质上是无序的，并在体外形成浓缩的液滴。该区域自我关联，并与结合伴侣如SPOP相互作用。DAXX在细胞核内的定位主要由其C端的SUMO相互作用模体（SUMO Interaction Motif, SIM）驱动。在ALT患病率高的肉瘤中，DAXX错义突变聚集在蛋白质的H3.3结合区域，这表明H3.3沉积可能是ALT抑制的关键。
一个简约的假设是，ATRX/DAXX/H3.3突变通过减少H3.3沉积从而改变染色质状态来增强ALT。事实上，ALT与端粒处染色质压缩程度的降低相关。然而，使这个模型复杂化的是，研究发现H3.3伴侣HIRA可以补偿ALT细胞中端粒处的H3.3沉积。这一结果对ATRX/DAXX介导的H3.3沉积必然是ALT抑制所必需的模型提出了质疑。
为了确定哪些疾病相关的DAXX突变意味着ALT，并剖析DAXX在ALT抑制中的功能，研究人员利用了G292骨肉瘤细胞系。在G292细胞中，ATRX是野生型的，但DAXX发生了与非常规驱动蛋白KIFC3的融合事件。在G292中恢复野生型DAXX可以使ATRX定位并消除ALT。利用该模型系统，研究人员测试了一组癌症相关的DAXX错义变异体抑制ALT的能力。研究发现，整个DAXX蛋白中的特定突变，包括DAXX H3.3结合域和四螺旋束，都会对DAXX抑制ALT的能力产生负面影响。令人惊讶的是，DAXX突变体抑制ALT的能力与通过染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）测量的端粒处H3.3沉积情况相关性不佳。相反，研究发现DAXX抑制ALT能力的最佳相关性是DAXX变异体与ATRX在核焦点中的共定位。重要的是，大多数H3.3结合突变体在ATRX定位方面也严重受损。这些结果强调了ATRX定位在ALT抑制中的重要性，并直接表征了人类癌症相关DAXX突变的ALT抑制表型。
结果
创建DAXX变异细胞系
为了剖析DAXX在ALT抑制中的功能作用，研究人员选择了一组DAXX的单氨基酸替换突变体。利用COSMIC数据库，研究人员选择了九个在肉瘤和PanNETs中发现的错义突变，这些突变遍布DAXX蛋白全长。其中三个（L130R, L134P, N153S）位于或邻近ATRX-DAXX结合界面。四个疾病相关突变（S220P, N268S, A297P, G321D）位于DAXX组蛋白结合域。Q469H突变位于无序的DAXX酸性区域。最后，D738V突变改变了C端的SIM模体，该模体是DAXX在PML核体（PML bodies）定位所必需的。这个SIM模体在G292中发现的DAXX融合蛋白中丢失了。研究人员还测试了两个实验确定的、已知会改变DAXX-H3.3界面的突变（图中以黑色标注）。Y222E突变消除了DAXX与H3.3的结合，而E225A使DAXX对任何H3变体都具有混杂性。
为了准确评估这些突变体抑制ALT的能力，研究人员使用pInducer-20慢病毒载体为每个DAXX变异体生成了具有可诱导DAXX表达的稳定细胞系。除DAXX-Y222E是先前生成并克隆的之外，细胞系均作为群体进行分析。细胞系持续在筛选条件下维持以防止DAXX插入位点沉默。用1 μg/mL多西环素诱导DAXX表达。在大多数细胞系中，这导致外源DAXX的表达高于内源蛋白，尽管DAXX-Y222E始终产生较低的蛋白水平。这与先前的观察结果一致，即H3.3结合能稳定DAXX。
为了确保变异的DAXX蛋白没有毒性，研究人员计算了每个细胞系在有和无DAXX诱导情况下的世代时间。在某些情况下，包括野生型，DAXX诱导导致世代时间显著减慢。与先前使用野生型DAXX诱导的流式细胞术观察结果一致，每个细胞系在DAXX诱导一周的过程中都持续增殖。研究人员注意到表达S220P的细胞系总是生长得更慢。基于细胞核大小，研究人员认为该细胞系在筛选过程中经历了基因组加倍事件，导致生长缓慢。虽然该细胞系明显与亲本系有显著差异，但研究人员继续在实验中使用它，并未发现它在ALT检测中表现为异常值。
DAXX突变体形成核焦点
野生型DAXX主要定位于细胞核，在那里除了弥散分布外还形成焦点。通过针对外源DAXX的HA标签进行免疫荧光显微镜检查，研究人员考虑了突变是否影响DAXX的定位。观察到所有DAXX突变体都主要定位于细胞核，并且所有突变体都在一定程度上定位于斑点。使用自动斑点检测，研究人员统计了每个细胞系中每个细胞核内至少包含16个像素的DAXX焦点。观察到L130R、L134P和N153S突变体每个细胞核平均形成的焦点数显著多于野生型DAXX。只有G321D突变体的斑点数量显著减少。计算焦点平均大小时，发现在DAXX-L134P细胞系中，DAXX焦点平均比野生型DAXX更大且数量更多。然而，G321D和D738V变异体的焦点显著更小。对于D738V，这可能反映了由于C端SIM模体受损而缺乏PML核体富集。
DAXX HBD突变体对ALT的抑制能力较差
接下来，研究人员检测了每个DAXX变异体抑制ALT的能力。研究人员依赖两种ALT活性的测量指标来评估抑制效果：C环（C-circles）和“ALT相关PML核体”（ALT-associated PML bodies, APBs）。C环是染色体外的端粒重复序列，是利用ALT进行端粒维持的细胞的标志。研究人员在DAXX诱导2天后测试了C环水平，并将其与未诱导的细胞系进行比较。正如先前报道的，在G292中诱导野生型DAXX表达可显著降低C环的产生，反映了ALT表型的抑制。在DAXX突变体组中，发现诱导L130R、L134P、N153S、E225A、N268S和Q469H能显著降低检测到的C环水平，这意味着这些变异体至少具有中等程度的ALT抑制能力。DAXX变异体S220P、Y222E、A297P、G321D和D738V无法将C环水平抑制到统计学上显著的程度。S220P、Y222E、A297P和G321D突变都位于组蛋白H3.3结合域内，暗示H3.3结合在ALT抑制中起关键作用。
在ALT中，端粒在核PML核体处聚集形成APB，新的端粒DNA在此合成。除了C环，APB的存在被认为是ALT的诊断指标。为了检测APB，研究人员进行了端粒荧光原位杂交（FISH）并结合PML的免疫荧光染色，并程序化地计数重叠的焦点。令人惊讶的是，发现诱导DAXX能显著降低每个细胞中每个细胞系的平均APB数量。研究人员证实，在多西环素处理的、没有可诱导转基因的G292细胞系中，多西环素不会减少APB，但从pInducer载体诱导NLS-mCherry也会统计学上降低平均每个细胞的APB数量，而诱导NLS-mCherry-3xSIM会减少APB但不影响C环。先前的报告显示，ATRX、DAXX和PML被招募到U2OS细胞中的可诱导CMV启动子，因此研究人员推断APB的普遍减少与可诱导启动子的表达激活有关，而不是ALT状态的改变。因此，研究人员转而关注APB减少的效应大小。发现Y222E、A297P和D738V减少每个细胞APB数量的能力最差，而E225A和Q469H减少APB的程度接近野生型DAXX。其他突变体表现出中等程度的抑制表型。
以C环的减少为指导，研究人员将DAXX突变体分为三组。Y222E、A297P和G321D突变体几乎没有抑制ALT的能力。L130R、L134P、N153S、S220P、N268S和D738V突变体具有有限的ALT抑制能力。最后，E225A和Q469H突变体抑制ALT的能力几乎与野生型DAXX一样好。研究人员注意到，三个在抑制ALT能力方面最受损害的DAXX变异体在H3.3结合域有突变，包括已被实验证明存在H3.3结合缺陷的Y222E。这些观察结果促使研究人员更仔细地探究H3.3沉积对ALT抑制的贡献。
端粒处H3.3沉积与ALT抑制相关性不佳
为了分离端粒处H3.3沉积对抑制ALT能力的贡献，研究人员选择了DAXX突变体Y222E、E225A和N268S（分别来自弱、强和中等ALT抑制组）进行H3.3染色质免疫沉淀（ChIP）。为了特异性确定端粒处H3.3沉积的变化，研究人员使用针对组蛋白H3.3的抗体下拉染色质，然后通过印迹检测端粒序列。研究人员比较了有和无外源DAXX表达的细胞系。预期野生型DAXX表达会显著增加端粒处的H3.3沉积，但发现通过H3.3 ChIP下拉的端粒序列比例的变化是适度的、可变的，并且最终没有统计学意义。N268S突变体表达的ChIP结果与野生型DAXX相似。正如预期，H3.3结合突变体Y222E的表达没有增加H3.3对端粒序列的下拉，对H3具有混杂性的E225A突变体也没有。总的来说，在这四个细胞系中，DAXX表达引起的端粒H3.3占据变化与各自DAXX突变体抑制ALT的能力相关性不佳。虽然该检测方法无法检测到端粒H3.3占据的微小变化，但这些结果说服研究人员考虑DAXX的其他功能可能对ALT抑制更为关键。
DAXX介导ATRX向PML核体和端粒的定位
G292细胞系对于ATRX是野生型的，并且ATRX结合DAXX-KIFC3融合蛋白。在先前的研究中，研究人员观察到在G292中表达WT DAXX会导致ATRX与DAXX和端粒共定位。与这一观察一致，发现WT DAXX的表达增加了ATRX向PML核体的定位。为了理解这种定位的功能重要性，研究人员在表达和不表达WT DAXX的G292中使用了针对ATRX的抗体进行了ChIP-seq。发现WT DAXX在G292中的表达增加了ATRX在端粒重复序列和GC含量≥50%的DNA序列上的结合。这一证据支持了一个模型，即DAXX介导ATRX正确定位到端粒序列。
ATRX-DAXX焦点与ALT抑制相关
鉴于DAXX将ATRX定位到端粒的重要性，研究人员希望了解ATRX定位在ALT抑制中的作用。在G292中，ATRX和内源性突变DAXX形成复合物，但不定位到焦点，这种定位失败使得ALT得以发生。因此，研究人员预期DAXX将ATRX定位到核焦点的能力对于ALT抑制至关重要。为了评估DAXX突变体定位ATRX的能力，研究人员使用共聚焦成像来计数ATRX-DAXX共定位的焦点。在G292细胞系中，ATRX主要是弥散的，但随着野生型DAXX的表达变得越来越呈点状。一部分ATRX和DAXX焦点重叠，这些重叠的焦点以每个细胞为基础进行计数。发现DAXX突变体E225A和Q469H（它们表现出强大的ALT抑制能力）也具有强大的ATRX-DAXX焦点形成能力。有时观察到表达DAXX-E225A的细胞有超过10个ATRX/DAXX焦点。在表达ALT抑制能力较低的DAXX突变体的细胞系中，观察到较少的ATRX-DAXX共定位焦点。因此，研究人员得出结论，在大多数情况下，DAXX抑制ALT的能力与其将ATRX定位到核焦点的能力相关。
讨论
本研究利用一组疾病相关的DAXX变异体来回答两个相互交织的问题。首先，DAXX在ALT抑制中的基本功能是什么？其次，哪些疾病相关的DAXX变异体允许ALT发生？研究人员得出结论，ALT抑制的基本要求是由DAXX C端SIM模体介导的ATRX在细胞核内的正确定位。观察到这种定位可能被4HB结构域、组蛋白结合域或C端SIM模体中的突变所破坏。重要的是，仅ATRX-DAXX功能的丧失不足以从头触发ALT，对ALT启动的探索超出了本文工作的范围。然而，研究人员可以得出结论，遍布DAXX蛋白序列的错义突变允许ALT发生。
研究人员在ATRX-DAXX H3.3伴侣复合物的背景下关注DAXX蛋白，但重要的是要认识到，据估计DAXX在细胞核中的丰度是ATRX的数倍，并且被认为参与其他复合物，例如与SPOP形成的复合物。在这项工作中，研究人员关注的是DAXX在一个携带DAXX融合蛋白的ALT阳性骨肉瘤细胞系中的背景。内源性DAXX被表达但由于C端SIM模体的丢失而无法正确定位。研究人员无法评论G292 DAXX-KIFC3融合蛋白或测试的任何DAXX突变体是否具有与ALT抑制无关的DAXX功能，因为该主题超出了本文描述的实验范围，并且需要 substantially 不同的方法。研究人员注意到，表达的DAXX变异体会与内源性DAXX竞争结合伴侣；因此，研究人员使DAXX变异体相对于内源性DAXX过表达。在G292中，WT DAXX的过表达导致世代时间变慢，这可能归因于ALT的抑制和端粒维持的缺乏，或者归因于其他DAXX结合伴侣的被滴定。研究人员测试的DAXX突变体都没有在该细胞系中赋予生长优势，无论它们抑制ALT的能力如何，而有几个导致了生长减慢。因此，至少在ALT细胞系的背景下，没有从检查的突变中观察到任何功能获得性生长优势。值得注意的是，G292细胞系具有TP53截短，因此研究人员无法评估DAXX在稳定或定位p53方面提出的活性。
与预期一致，即ALT易感癌症中的大多数DAXX突变会增强ALT，研究人员测试的九个疾病相关突变中有八个不完全抑制ALT。然而，所有疾病相关的DAXX变异体都比实验定义的Y222E突变体具有更强的ALT抑制表型。在野生型DAXX中，Y222形成了一个疏水口袋的一部分，该口袋结合H3.3残基I89，这是H3.3和H3.1/2之间不同的五个残基之一。Y222E突变用带电荷的谷氨酸取代了疏水的酪氨酸残基，破坏了DAXX结合H3.3的能力。在研究人员手中，Y222E的蛋白水平始终低于任何其他DAXX变异体，这与DAXX需要H3.3结合来维持蛋白稳定性的观察结果一致。研究人员推测，低水平的DAXX-Y222E蛋白可能驱动了观察到的更强表型，并且如此低的DAXX蛋白表达在疾病背景下可能赋予选择性劣势。
在测试的疾病相关DAXX突变中，只有位于无序酸性区域的Q469H突变以与野生型DAXX相当的程度抑制了ALT。DAXX无序区域的突变可能预期会影响蛋白质形成相分离焦点的能力，但Q469H形成的焦点在大小和数量上与野生型DAXX相似。值得注意的是，该突变记录在一个骨肉瘤样本中，在该样本中还观察到了组蛋白结合区的DAXX E201D突变，尽管这些突变的接合性未知。基于观察，似乎有理由认为，该样本中的E201D DAXX突变赋予了ALT表型，而Q469H突变则作为中性乘客或影响了DAXX与ALT抑制无关的功能。
研究人员预期端粒处的H3.3沉积对于ALT抑制是必需的。与在S期合成和沉积的经典H3组蛋白不同，H3.3变体在整个细胞周期中合成，并作为经历高核小体周转率的基因组区域的替代组蛋白。具体来说，这包括高度转录的区域，其中H3.3由HIRA沉积，以及着丝粒周围和端粒区域，其中H3.3由ATRX-DAXX沉积。组蛋白H3变体在其蛋白质相互作用组中有所不同，包括与染色质修饰因子的相互作用，因此研究人员预计端粒处特异性H3.3的丢失将导致有利于ALT的染色质环境改变。研究人员预测，损害端粒处H3.3沉积的DAXX突变将无法抑制ALT。研究人员对E225A DAXX突变的行为特别感兴趣，因为它混杂地结合H3组蛋白变体。由于H3.3只占总合成H3组蛋白的一小部分，研究人员预计DAXX-E225A将主要沉积其他H3变体，因此判断这将是对H3.3本身与其他H3组蛋白在端粒处ALT抑制中是否必需的测试。研究人员发现DAXX E225A抑制ALT的程度与野生型DAXX相当，没有因沉积经典H3而出现明显的缺陷。使用H3.3 ChIP并探测端粒序列，研究人员发现端粒处H3.3沉积的程度与野生型、Y222E、E225A和N268S DAXX变异体抑制ALT的能力之间没有相关性。ChIP实验是一个不完美的检测方法，无法检测到DAXX表达引起的H3.3沉积的微小增加，但这使研究人员考虑到H3.3沉积可能不是ATRX/DAXX抑制ALT所必需的。已经证明HIRA可以补偿ATRX/DAXX在端粒异染色质处沉积H3.3，以至于ALT细胞对HIRA的缺失敏感，这或许解释了研究人员观察到的野生型DAXX表达后端粒处H3.3不一致的增加。研究人员得出结论，端粒处的H3.3沉积可能不直接为ALT抑制所必需。
DNA修复机制向端粒的定位对于ALT机制至关重要，而PML核体作为聚集这些因子的关键场所起着关键作用。野生型DAXX通过其C端SIM模体定位到PML核体。在G292细胞系中，DAXX-KIFC3融合蛋白失去了这个SIM模体，产生了一个能结合ATRX但不能定位到PML核体的蛋白质。因此，研究人员发现，为了对抗发生在PML核体的ALT机制，DAXX必须既结合ATRX又正确定位到PML核体。研究人员满意地观察到，D738V SIM结构域突变体（类似于G292内源性的DAXX-KIFC3融合蛋白）对ALT的抑制能力很差，这强化了DAXX C端SIM模体在ATRX/DAXX定位中的重要性。研究人员还观察到，在DAXX 4HB ATRX结合区有突变的DAXX变异体不完全抑制ALT。研究人员预计ALT抑制的水平可能与ATRX结合缺陷的程度有关；这可能是未来探索的一个富有成果的途径。值得注意的是，在ATRX结合位点有突变的DAXX变异体每个都被观察到比其他DAXX变异体形成更多和更大的核DAXX焦点。可能ATRX与其他DAXX结合伴侣（如SPOP）竞争。在没有ATRX结合的情况下，DAXX可能形成不同的复合物，这些复合物更容易发生相分离。或者，没有ATRX的DAXX焦点可能代表停滞的生物组装体，在没有ATRX活性的情况下无法解决。
最后，最令研究人员惊讶的是，在组蛋白结合域有突变的DAXX变异体未能定位ATRX。研究人员的预期是这些突变将作为功能分离，定位ATRX但不沉积组蛋白H3.3。其他报告中也做出了
