《Clinical Immunology》：Targeting CDH2 and TUBA1A in Neuroblastoma Bone Marrow Metastasis: Insights from Single-Cell Analysis and Drug Screening
编辑推荐：
本研究针对神经母细胞瘤骨髓转移机制不明的临床难题，通过单细胞转录组分析与孟德尔随机化方法，首次鉴定CDH2和TUBA1A为关键转移促进基因。功能实验证实两者通过调控细胞周期和信号通路影响肿瘤进展，并发现DMNQ可通过抑制这两个靶点显著抑制神经母细胞瘤生长，为临床治疗提供了新的潜在策略。
神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体肿瘤，尤其令人担忧的是，超过50%的患儿在确诊时已发生转移，其中90%以上的转移病例涉及骨髓浸润。尽管近年来免疫治疗和靶向药物取得了显著进展，但高危神经母细胞瘤患儿的5年总生存率仍仅为45%，而伴有骨髓转移的患儿生存率更是低于10%。这种严峻的临床现状凸显了深入探究神经母细胞瘤骨髓转移分子机制的紧迫性。
传统研究多聚焦于MYCN基因扩增在神经母细胞瘤转移中的作用，然而临床观察发现，即使在没有MYCN扩增的病例中，骨髓转移仍然频繁发生。这一现象提示我们，除了MYCN之外，必然存在其他关键分子驱动着神经母细胞瘤的骨髓转移过程。由于骨髓转移的分子机制尚未完全阐明，开发针对性的治疗策略面临重大挑战。
为破解这一难题，研究人员在《Clinical Immunology》上发表了最新研究成果。该研究创新性地结合单细胞转录组测序和孟德尔随机化分析，系统揭示了神经母细胞瘤骨髓转移的关键分子机制，并筛选出具有潜在治疗价值的化合物。
研究团队采用了几项关键技术方法：从GEO数据库获取了10例神经母细胞瘤样本（5例伴骨髓转移，5例无转移）进行单细胞RNA测序分析；利用孟德尔随机化方法从146个标记基因中筛选关键基因；通过TCGA和CCLE数据库进行批量转录组分析；采用免疫组化、Western blot、RT-qPCR等技术验证基因表达；使用细胞活力检测、细胞周期分析、划痕实验等功能实验评估基因功能；通过分子对接筛选潜在抑制剂。
Identification of 146 NB Marker Genes Associated with BM Metastasis via Single-Cell Transcriptomic Analysis
研究人员首先对5例伴骨髓转移和5例无转移的神经母细胞瘤样本进行单细胞转录组分析，共获得56,674个高质量细胞。通过UMAP（均匀流形近似和投影）分析鉴定出7种主要细胞类型：髓系细胞、T细胞、B细胞、红细胞、树突状细胞、造血干细胞和神经母细胞瘤细胞。值得注意的是，与无转移组相比，骨髓转移组的神经母细胞瘤细胞表现出更复杂的拷贝数变异模式。通过差异表达分析，研究团队成功识别出146个与骨髓转移相关的标记基因。
Key Genes Potentially Promoting BM Metastasis Identified via MR Analyses
对这146个标记基因进行功能富集分析发现，它们显著富集于核糖体小亚基生物合成、T细胞分化等生物学过程，以及核糖体、安非他明成瘾等信号通路。为进一步筛选关键基因，研究人员采用孟德尔随机化方法，利用来自4,881个样本的GWAS（全基因组关联研究）数据，最终鉴定出CDH2（N-钙黏蛋白）和TUBA1A（微管蛋白α1A）两个关键基因。其中CDH2表达增加会提升骨髓转移风险（OR=2.278），而TUBA1A则表现出保护作用（OR=0.376）。生存分析进一步证实，高表达CDH2或低表达TUBA1A均与患者不良预后显著相关。
Regulatory Pathways and Transcriptional Analysis of Key Genes in NB
基因集变异分析显示，CDH2高表达与MTORC1信号通路和DNA修复通路激活相关，而TUBA1A高表达则富集于Hedgehog和PI3K-AKT-MTOR通路。基因集富集分析表明，CDH2主要影响细胞周期和DNA复制过程，TUBA1A则调控细胞黏附分子和cAMP信号通路。转录因子预测发现，cisbp__M5788可能是调控这两个基因的关键 motif。与已知神经母细胞瘤相关基因的关联分析揭示，CDH2与PTPN11呈正相关，与FGFR1负相关；TUBA1A与KIF1B正相关，与TP53负相关。
Impact of Key Genes on the Immune Microenvironment in NB
肿瘤免疫微环境分析发现，CDH2和TUBA1A表达水平与特定免疫细胞亚群的比例变化密切相关。高表达CDH2的样本中naive CD4+T细胞比例升高，而活化肥大细胞、单核细胞等比例降低。TUBA1A高表达则与调节性T细胞和静息肥大细胞增多相关，而与活化肥大细胞、浆细胞等减少相关。这些发现提示这两个基因可能通过调节免疫细胞浸润影响肿瘤的免疫逃逸过程。
Visualization of Key Gene Expression and Global Functional Analysis
单细胞水平表达分析证实，CDH2和TUBA1A在骨髓转移组的神经母细胞瘤细胞中显著高表达。AUCell算法分析显示，这两个基因的表达与多种免疫和代谢通路活性相关。共表达分析发现CDH2与肿瘤抑制基因KIF1B、NBAT1负相关，而TUBA1A与KIF1B正相关，进一步揭示了它们在神经母细胞瘤中的不同功能角色。
Analysis of CDH2 and TUBA1A Expression in NB Cell Lines and Patient Samples
实验验证表明，与HEK293T细胞相比，神经母细胞瘤细胞系中CDH2和TUBA1A的mRNA和蛋白水平均显著升高。泛癌分析显示这两个基因在神经母细胞瘤中的表达水平相对较高。对12例患儿样本的免疫组化分析发现，高危神经母细胞瘤组织中CDH2和TUBA1A蛋白表达明显高于低危组织，支持了它们在疾病进展中的重要作用。
Knockdown of CDH2 or TUBA1A Induces Cell Cycle Arrest and Suppresses NB Cell Proliferation and Migration
功能实验表明，敲低CDH2或TUBA1A可显著抑制神经母细胞瘤细胞增殖和迁移能力。机制上，敲低这两个基因导致细胞周期蛋白D1和D2表达下降，引起G1期细胞周期阻滞。划痕实验证实基因敲低 impair细胞迁移能力。小鼠模型实验进一步验证，敲低CDH2或TUBA1A可减少骨髓中CD45-GD2+神经母细胞瘤细胞数量，表明这两个基因确实参与调控体内转移过程。
Identification of DMNQ as a Compound with Inhibitory Activity on NB
通过分子对接筛选，研究人员发现DMNQ（2,3-二甲氧基-1,4-萘醌）与CDH2和TUBA1A具有较高的结合亲和力（结合能分别为-6.0 kcal/mol和-7.2 kcal/mol）。细胞实验表明，DMNQ处理可剂量依赖性地抑制神经母细胞瘤细胞活力，IC50值约为13-14 μM。Western blot证实DMNQ处理可显著降低CDH2和TUBA1A的蛋白表达水平，与其分子对接预测结果一致。
研究结论与讨论部分强调，该研究通过整合单细胞测序和孟德尔随机化方法，首次系统揭示了CDH2和TUBA1A在神经母细胞瘤骨髓转移中的关键作用。这两个基因通过调控细胞周期、信号通路和免疫微环境等多种机制促进肿瘤进展。特别重要的是，研究发现DMNQ能够同时靶向抑制CDH2和TUBA1A，显著抑制神经母细胞瘤细胞生长，为临床治疗提供了新的候选药物。
该研究的创新点在于将前沿的组学分析方法与实验验证相结合，不仅揭示了神经母细胞瘤骨髓转移的新机制，还提出了具有转化潜力的治疗策略。尽管研究存在样本量有限、MR分析假设依赖等局限性，但多层次证据的一致性支持了结论的可靠性。未来研究需要进一步探索DMNQ的体内药效和安全性，以及CDH2/TUBA1A信号通路与其他治疗方法的协同效应，为改善高危神经母细胞瘤患儿的预后提供新希望。
