合成大麻素与设计苯二氮?类对原代大鼠皮质神经元网络自发电活动的抑制效应研究

《NeuroToxicology》：Inhibitory effects of (synthetic) cannabinoids and (designer) benzodiazepines on spontaneously active neuronal networks of primary rat cortical cultures in vitro

本研究针对新型精神活性物质（NPS）神经毒性不明的问题，利用微电极阵列（MEA）技术评估了CBD、合成大麻素受体激动剂（RCS-4）、经典苯二氮?类（地西泮、奥沙西泮、劳拉西泮）和设计苯二氮?类（氟硝唑仑、氟替唑仑）对原代大鼠皮质神经元网络活动的急性影响。结果显示所有化合物均呈浓度依赖性抑制神经元活动，其中设计苯二氮?类效力最强（最低观测效应浓度低至0.01-0.03 μM），突显其潜在神经毒性风险。该研究为NPS的神经毒性评估和效价排序提供了重要方法学支持。

　　

随着新型精神活性物质（Novel Psychoactive Substances, NPS）在全球范围内的滥用趋势日益严重，其对公共健康构成的威胁不容忽视。过去20年间，市场上涌现的NPS数量从2005年的33种激增至2021年的399种，每年仍有10-100种新物质出现。这些经过巧妙化学结构修饰的化合物，旨在规避法律监管的同时模拟传统毒品的效应，但往往缺乏系统的毒理学研究。其中，合成大麻素受体激动剂（Synthetic Cannabinoid Receptor Agonists, SCRAs）和设计苯二氮?类（Designer Benzodiazepines, DBs）是两类尤为令人担忧的NPS。SCRAs是数量最多的NPS类别，并与大量NPS相关住院和死亡事件相关；而苯二氮?类虽然在滥用药物中占比并非最高，却在多国药物相关死亡案例中频繁出现。由于这些物质通常未经严格的临床试验和毒理学评估，其药理和毒理特性大多未知，加之产品误标、剂量不确定等问题，使得其健康风险难以估量。传统的体内动物实验存在伦理争议且通量低，而电生理金标准技术如膜片钳又耗时费力，难以应对NPS的快速涌现。因此，开发高效、可靠的体外神经毒性评估方法迫在眉睫。

在此背景下，发表在《NeuroToxicology》上的研究论文《Inhibitory effects of (synthetic) cannabinoids and (designer) benzodiazepines on spontaneously active neuronal networks of primary rat cortical cultures in vitro》应运而生。该研究旨在利用微电极阵列（Microelectrode Array, MEA）技术，系统评估多种大麻素（包括大麻二酚CBD和合成大麻素RCS-4）和苯二氮?类（包括三种经典苯二氮?和两种设计苯二氮?）对原代大鼠皮质神经元网络自发电活动的急性影响，从而为这些NPS的神经毒性危害评估和效价排序提供科学依据。

研究人员采用了几项关键技术方法开展本研究。核心是利用微电极阵列（MEA）技术，在体外培养的原代大鼠皮质神经元网络（培养自新生Wistar大鼠皮质组织，在微电极阵列板上培养至15-16天）上，记录神经元自发电活动（包括 spikes、bursts、network bursts 等多个参数）。研究团队将不同浓度的待测化合物（CBD、RCS-4、地西泮、奥沙西泮、劳拉西泮、氟硝唑仑、氟替唑仑）急性暴露于神经元网络，通过比较暴露前后（各记录30分钟，分析后20分钟的稳定数据）的电活动变化来评估其神经调制作用。所有测试均设置了溶剂（DMSO）对照，并通过alamarBlue assay排除了化合物在测试浓度下的细胞毒性影响。数据分析采用了定制化的宏和统计软件（SPSS, GraphPad Prism），计算了半数抑制浓度（IC₅₀）和最低观测效应浓度（LOEC）等关键参数。

3. 结果

3.1. 大麻素对神经元活动的抑制效应

急性暴露于CBD和合成大麻素RCS-4均导致神经元活动的浓度依赖性抑制。CBD在浓度≥3 μM时开始显著降低 spikes、bursts、network bursts 等多个主要活动参数，在10 μM时几乎完全抑制神经元活动。RCS-4表现出更强的抑制效力，在≥1 μM时即显著降低神经元活动，其IC₅₀值（1.1 μM）低于CBD（2.9 μM），表明RCS-4是更强效的神经元活动抑制剂。

3.2. 经典苯二氮?类的抑制效应

三种经典苯二氮?类（地西泮、奥沙西泮、劳拉西泮）均浓度依赖性地抑制神经元活动。地西泮（LOEC = 0.1 μM）和劳拉西泮（LOEC = 0.1 μM）在抑制 spike 频率方面效力相近，而奥沙西泮（LOEC = 1 μM）相对较弱。但在抑制 network burst 频率方面，奥沙西泮的IC₅₀值（4.1 μM）低于地西泮（8.5 μM）和劳拉西泮（19.6 μM）。值得注意的是，在抑制总体神经元活动的同时，苯二氮?类暴露还伴随着 burst 持续时间的延长。

3.3. 设计苯二氮?类的强效抑制

两种设计苯二氮?类（氟硝唑仑和氟替唑仑）表现出异常强的抑制效力。氟硝唑仑的LOEC低至0.01 μM，氟替唑仑的LOEC为0.03 μM。它们的IC₅₀值分别为11 nM和127 nM，远低于测试的经典苯二氮?类。与经典苯二氮?类类似，设计苯二氮?类在抑制总体活动的同时，也引起 burst 持续时间的显著延长，这可能与神经元网络同步化活动被破坏有关。

4. 讨论与结论

本研究首次利用MEA技术系统比较了CBD、合成大麻素RCS-4、经典苯二氮?类和设计苯二氮?类对原代大鼠皮质神经元网络活动的抑制效力。结果表明，所有测试化合物均能浓度依赖性地抑制自发性神经元网络活动，且这种抑制并非由细胞毒性引起。设计苯二氮?类（尤其是氟硝唑仑）的抑制效力显著高于经典苯二氮?类，其IC₅₀值达到纳摩尔级别，突显了其巨大的潜在神经毒性风险。CBD的抑制效应可能与其对GABA_A受体的正变构调节作用有关，而非通过大麻素CB1受体。研究还发现，在线购买的物质存在误标现象（购买的“THC-C4”实际为RCS-4），这揭示了NPS市场的又一风险。

将MEA测得的有效浓度与已知的经典苯二氮?类有效血药浓度进行比较，发现两者具有较好的一致性，这验证了MEA模型在预测体内神经效应方面的适用性。然而，由于缺乏设计苯二氮?类和RCS-4的人体药代动力学数据，其体外效力与体内实际风险的确切关系仍需进一步研究。尽管如此，荷兰毒物信息中心报告的与设计苯二氮?类相关的中毒案例急剧增加，已从实践层面印证了这类物质的高度危险性。

综上所述，该研究成功证明了MEA记录技术可用于不同（设计）药物的神经毒性评估和效价排序。研究结果不仅揭示了CBD、RCS-4以及设计苯二氮?类对神经元网络的强效抑制作用，更重要的是为评估快速涌现的NPS的健康危害提供了一种可靠、相对高通量的体外筛选平台。这些发现强调了加强对NPS（特别是高效力的设计苯二氮?类和合成大麻素）的监管与毒理学研究的紧迫性，对保障公共健康安全具有重要意义。