生长耦合进化策略显著提升酿酒酵母血红素生物合成及其在可持续单细胞蛋白中的应用

《Biotechnology Journal》：A Growth-Coupled Evolutionary Strategy Enhances Heme Biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae

本研究创新性地将生长加速靶向进化（GATE）平台应用于酿酒酵母，通过构建血红素响应性CYC1启动子驱动生长促进基因PTH1的表达回路，经100小时连续培养与质粒消除，成功筛选出非转基因突变株Evol-GATE。该突变株胞内血红素含量提升约6.5倍，且全基因组测序证实无外源质粒残留，为开发高血红素强化型单细胞蛋白（SCP）及下一代人造肉提供了安全高效的菌株选育策略。

　　

1 引言

铁作为人体必需微量元素，以血红素和非血红素形式被吸收，其中血红素铁因受膳食抑制剂影响小且生物利用度高而更具营养优势。传统肉类通过血红蛋白和肌红蛋白提供丰富血红素来源，但畜牧业面临的环境与资源压力促使人们探索微生物单细胞蛋白（SCP）等可持续替代方案。酿酒酵母因其高蛋白含量、均衡氨基酸组成及公认安全（GRAS） status被广泛关注，然而其天然血红素含量较低，限制了其在模拟肉类风味和铁营养强化方面的应用。近年来，代谢工程与进化策略已被用于提升微生物宿主（如酵母）的血红素产量，但多数方法依赖遗传修饰。本研究旨在通过生长加速靶向进化（GATE）策略，在酿酒酵母中建立血红素合成与细胞增殖的自我强化回路，最终获得非转基因的高血红素生产菌株。

2 材料与方法

2.1 菌株与培养基

以酿酒酵母BY4742为亲本型（PT），使用合成限定（SD）培养基和YPD复合培养基进行培养。

2.2 质粒构建

以pRS327为载体骨架，通过Gibson组装将血红素敏感型CYC1启动子与生长促进基因PTH1连接，构建表达盒（图1），并通过LiAc/PEG法转化酵母。

2.3 培养条件

分批培养在500 mL挡板瓶中进行，5 L发酵罐实验控制溶氧100%、pH 5.6。

2.4 适应性进化连续培养

在最小培养基中建立连续培养系统，维持恒定培养体积并通过逐步提高进料速率施加选择压力。

2.5 质粒消除

通过PEG3350处理及赖氨酸缺陷型培养基筛选，获得质粒消除突变株。

2.6 血红素测定

采用丙酮-HCl法提取总血红素与蛋白结合血红素，通过HPLC（C18柱，检测波长398 nm）定量。

2.7 ROS检测

使用DCFH-DA探针测量细胞内活性氧（ROS）水平，荧光强度归一化至OD₆₀₀。

2.8 转录组分析

通过3′ mRNA-Seq（Illumina NextSeq 2000）检测基因表达，差异表达分析基于TMM+CPM标准化。

2.9 全基因组测序（WGS）

使用Illumina Novaseq X平台进行双端测序，变异调用通过GATK HaplotypeCaller完成，参考基因组为S288C。

3 结果与讨论

3.1 血红素响应性GATE回路设计

通过将HAP1转录因子结合的血红素敏感型CYC1启动子与核糖体翻译关键因子PTH1耦合，建立正反馈回路：血红素水平升高激活HAP1，驱动PTH1表达促进增殖，进而强化血红素蛋白合成（图1）。补充5-ALA可诱导该回路初步激活（图S1）。

3.2 适应性进化富集高产血红素菌株

在最小培养基中连续培养300小时，GATE组在100小时时血红素含量达峰值，随后逐渐回落（图2），表明长期进化可能导致代谢负担减轻的表型逆转。因此选择100小时样本进行质粒消除，获得Evol-control与Evol-GATE菌株。

3.3 生物量与血红素积累谱

在复合培养基中，Evol-GATE的最大生物量显著低于PT，但血红素含量提高约5倍（1.5 mg/L），且5 L发酵罐中进一步提升至6.5倍（图3，图S4）。复合培养基的丰富前体更利于GATE策略展现血红素合成优势。

3.4 游离血红素诱导氧化应激与凋亡

Evol-GATE中游离血红素占比约20%（0.3 mg/L），导致ROS水平升高6倍（图3E）。凋亡相关基因（YCA1、DNM1、AIF1、NUC1、NMA111）mRNA显著上调（图4A），表明游离血红素过载引发氧化损伤与程序性死亡，解释其生长受限现象。

3.5 血红素稳态的转录重编程

Evol-GATE中血红素降解酶基因HMX1、输出蛋白基因PUG1及调控因子ROX1表达上调，但未能逆转血红素积累（图4A）。核心血红素合成通路基因（HEM3、HEM4、HEM13等）协同上调（图4B），而Evol-control仅个别基因变化且HEM4显著抑制，说明GATE特异性驱动通路整体激活。

3.6 WGS验证非转基因状态与突变特征

WGS显示Evol-GATE核基因组覆盖度>99.9%，pRS327同源区域仅部分匹配，无完整质粒整合（表S3）。与Evol-control相比，Evol-GATE特异性变异仅22个（表1），涉及铁稳态（BOL2）、染色质调控（RSC30）等基因，但核心血红素合成与调控基因无突变，表明表型由转录重编程而非关键突变主导。

4 结论

GATE策略通过血红素响应性生长耦合回路，成功选育出血红素产量显著提升且无外源基因整合的酿酒酵母突变株。转录组与基因组分析证实其代谢通路重构与非转基因特性，为开发血红素强化型SCP提供了安全高效的菌株开发平台。