《The FASEB Journal》：Liraglutide Ameliorates Injury-Related Vascular Repair by Activating Autophagy Through Modulation of the PI3K–mTOR Signaling Pathway
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本文深入探讨了利拉鲁肽（liraglutide）在慢性应激（chronic stress）诱导的血管损伤修复中的作用机制。研究发现，利拉鲁肽可通过抑制PI3K-mTOR信号通路，增强自噬（autophagy）水平，从而抑制血管平滑肌细胞（VSMCs）的异常增殖、迁移和凋亡，有效减轻术后再狭窄（postoperative restenosis）及血管内膜增厚。该研究为心血管疾病（CVD）的防治提供了新的潜在靶点和治疗策略，具有重要的临床意义。
引言
随着现代社会快速发展，工作压力增大和生活节奏加快，慢性应激日益普遍，并导致心血管疾病发病率上升。慢性应激是指机体在体内外各种不良因素长期刺激下，内环境稳态失衡所引起的非特异性病理生理反应。大量研究表明，慢性应激不仅是影响人生理功能和生存的重要因素，还在高血压、动脉粥样硬化、术后再狭窄等多种心血管疾病的发生发展中起重要介导作用。血管内介入治疗是血管阻塞的常用方法，但该方法常伴有术后再狭窄等严重并发症，其发生率可达33%。利拉鲁肽是一种胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）激动剂，除血糖调节外，其心血管保护作用备受关注，然而其具体作用机制尚不明确。自噬是一种细胞降解途径，通过清除受损细胞器和病原体，在细胞代谢、能量稳态、饥饿适应、生长和细胞死亡调控中起关键作用。本研究旨在探讨利拉鲁肽对慢性应激诱导的损伤血管内膜增厚的影响，并阐明其潜在机制。
材料与方法
本研究采用慢性应激和颈动脉内膜损伤的双重体内模型，探讨慢性应激对血管损伤小鼠颈动脉和肝组织血管形态、血液生化以及自噬和凋亡相关蛋白表达的影响。通过体外实验检测利拉鲁肽对血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖、迁移和凋亡的影响。动物实验将C57BL/6J雄性小鼠随机分为应激组、非应激组、应激+生理盐水组、应激+利拉鲁肽组、应激+自噬抑制剂3-MA组以及应激+利拉鲁肽+3-MA组，建立慢性应激模型和颈动脉结扎损伤模型。通过H&E染色、Western blot、流式细胞术、TUNEL染色、细胞划痕实验等方法检测相关指标。
结果
利拉鲁肽减轻自噬抑制剂诱导的慢性应激下病理性内膜增厚
H&E染色结果显示，慢性应激显著增加了损伤动脉的内膜病变形成和内膜面积与中膜面积的比值。利拉鲁肽治疗显著降低了慢性应激条件下损伤颈动脉的新内膜面积和内膜/中膜比值。自噬抑制剂3-MA加重了内膜增生，而利拉鲁肽与3-MA联合应用可控制病理性增生，降低内膜增生面积和内膜/中膜比值，表明利拉鲁肽可能通过诱导自噬缓解慢性应激诱导的术后再狭窄。
利拉鲁肽通过激活自噬减轻慢性应激诱导的术后再狭窄
Western blot结果显示，在模型建立后第4天，利拉鲁肽降低了颈动脉组织中PI3K和mTOR的磷酸化水平，增加了Atg5、Beclin-1的表达和LC3II/I比值。与3-MA组相比，3-MA+利拉鲁肽组降低了PI3K和mTOR的磷酸化，增加了Atg5、Beclin-1的表达和LC3II/I比值。表明慢性应激导致自噬功能抑制，加速术后再狭窄进程，而利拉鲁肽通过激活自噬缓解这一过程。
利拉鲁肽影响小鼠肝组织自噬相关因子的表达
在肝组织中，利拉鲁肽逆转了慢性应激引起的Beclin-1、Atg7、Atg5水平下降和LC3II/I比值降低，并显著降低了PI3K、p-mTORser2448/mTOR、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3和Bax的表达。同样，与3-MA组相比，3-MA+利拉鲁肽增加了慢性应激小鼠肝组织中Beclin-1、Atg7、Atg5蛋白水平和LC3II/I比值。表明利拉鲁肽通过抑制PI3K/mTOR通路最终激活自噬。
利拉鲁肽降低慢性应激小鼠血清和肝脏甘油三酯水平，逆转体重减轻和内脏脂肪减少，延缓主动脉衰老
利拉鲁肽给药后，血清和肝组织中的TG水平显著降低，慢性应激诱导的肝损伤和脂质积聚得到改善，肝组织中PLIN2和DPP4的蛋白表达水平降低。利拉鲁肽还逆转了体重减轻，显著降低了慢性应激和自噬抑制剂组小鼠的血糖和血压水平，并有效延缓了血管衰老。
利拉鲁肽有效抑制VSMCs的增殖、迁移、凋亡并促进自噬
体外实验结果表明，利拉鲁肽抑制了VSMCs的增殖和迁移能力，降低了其凋亡率，而自噬抑制剂3-MA则增加了凋亡率。
利拉鲁肽有效抑制慢性应激下动脉平滑肌细胞的迁移并促进自噬
与对照组相比，利拉鲁肽显著抑制了平滑肌细胞萌发的数量和面积，而自噬抑制剂3-MA则促进了细胞萌发的数量和面积。Western blot分析显示，利拉鲁肽促进了SMC中Beclin-1、Atg5的表达和LC3II/I比值，而3-MA抑制了上述蛋白水平的表达。
讨论
心血管疾病已成为全球老龄化社会的主要死亡原因，并带来了沉重的社会负担。慢性应激可导致下丘脑-垂体-肾上腺轴过度激活，最终导致心血管疾病患者形成血栓。长期暴露于慢性应激可诱导局部或全身持续性炎症反应，损害自噬调节过程，促进血管内膜病理性增厚，加速血管衰老，引起血脂水平异常，从而增加心血管疾病风险。本研究采用颈动脉损伤和慢性应激双重模型，探讨了慢性应激对术后再狭窄的影响。
术后再狭窄是由于血管损伤后新内膜异常迁移所致，常发生在心脏和周围血管成形术、搭桥术和动脉内膜切除术后，是影响血管内介入治疗远期疗效的主要因素，并显著增加心血管事件死亡率。术后再狭窄的病理生理学涉及血管炎症、VSMC增殖和内膜增生等一系列过程。长期暴露于慢性应激可加速术后再狭窄的进展，最终导致严重的心血管不良事件。
利拉鲁肽作为一种新型降糖药，已知用于治疗糖尿病和肥胖症，但其在预防或治疗心血管疾病方面的作用尚未见报道。本研究建立慢性应激和颈动脉损伤双重小鼠模型，探讨利拉鲁肽是否能改善慢性应激。
从手术损伤到再狭窄通常经历三个阶段：血栓形成、内膜增生和血管重塑。在内膜增厚阶段，VSMCs从中层迁移到内膜。本研究通过测量颈动脉损伤后第14天的颈动脉内膜-中层厚度（CIMT）来评估慢性应激对内膜的影响以及利拉鲁肽的治疗效果。
自噬是一个重要的分解代谢过程，在维持细胞稳态、蛋白质质量控制和适应性应激反应中起关键作用。自噬在细胞应激或饥饿时被激活，在细胞代谢、能量稳态、饥饿适应、发育和细胞死亡的调控中起重要作用，也被称为II型程序性细胞死亡。适度的自噬可以及时清除受损细胞，维持机体功能稳定。先前研究表明，自噬是心血管疾病发生发展的双向调节因子。细胞自噬的关键方面涉及Beclin-1和LC3蛋白的表达。具体来说，Beclin-1启动自噬，而LC3作为自噬的典型标志物，LC3II的表达水平与自噬体数量成正比。本研究结果表明，慢性应激降低了Beclin-1、Atg5的表达和LC3-II/I比值，与自噬抑制剂3-MA的效果相似。这些发现表明慢性应激导致自噬抑制，进而导致内膜发育不良并最终导致再狭窄，而利拉鲁肽可逆转这一过程。利拉鲁肽可缓解慢性应激诱导的自噬标志物Beclin-1、Atg5表达水平和LC3II/I比值的降低。同样，在自噬抑制剂3-MA存在的情况下，利拉鲁肽给药也观察到相同的结果。研究表明，利拉鲁肽通过促进自噬和改善血管生成，逆转了自噬抑制剂3-MA引起的Beclin-1和LC3表达水平的降低，这与本研究结果一致。本研究显示，给予自噬抑制剂3-MA后，小鼠颈动脉出现与慢性应激条件下相似的内膜增厚。然而，使用3-MA加利拉鲁肽治疗后仍可达到有效的治疗效果。这些结果表明，利拉鲁肽有潜力修复慢性应激诱导的自噬相关损伤组织，并有效缓解相关的术后再狭窄。
多条通路调控自噬，最典型的是PI3K-mTOR通路。PI3K激活导致mTOR激活，随后抑制自噬。最近一项研究报告称，高良姜素抑制mTOR信号通路以及VSMC增殖、迁移和表型转换，增加Beclin1蛋白表达比值和LC3II/I比值，从而促进VSMC自噬，抑制血管内膜增厚，进而预防和改善术后再狭窄。本研究中，我们观察到慢性应激促进了PI3K和mTOR的磷酸化，利拉鲁肽治疗后这一现象被逆转。这表明利拉鲁肽通过抑制PI3K-mTOR通路逆转了慢性应激诱导的自噬破坏。研究表明，利拉鲁肽可通过降低Beclin-1和LC3II的表达水平，调节凋亡相关蛋白的表达，逆转T2DM模型大鼠诱导的mTOR升高和PI3K表达降低，从而改善大鼠认知功能障碍。为验证利拉鲁肽是否通过PI3K-mTOR通路激活自噬对抗慢性应激诱导的内膜增生，我们使用自噬抑制剂3-MA抑制自噬，随后联合给予利拉鲁肽和3-MA。结果显示，3-MA组与生理盐水组表现相似：mTOR磷酸化和PI3K表达水平升高，Beclin-1、Atg5和LC3II/I比值降低。然而，3-MA和利拉鲁肽联用逆转了这些效应，部分恢复了自噬水平的下降。这些发现表明，利拉鲁肽可能通过抑制PI3K-mTOR信号通路恢复自噬，从而缓解慢性应激诱导的术后再狭窄。
肝脏是代谢发生的主要器官，因此极易受到慢性应激的影响。研究表明慢性应激影响肝脏，而利拉鲁肽发挥治疗和保护作用。维持肝脏自噬和凋亡之间的平衡对于正常肝脏生理至关重要。据报道，慢性应激会促进肝损伤，而自噬具有治疗肝病的潜力。因此，本研究也对肝脏进行了深入研究。本研究的Western blot结果显示，在慢性应激条件下，Beclin-1、Atg7、Atg5的水平和LC3-II/I比值下降，而PI3K、p-mTORser2448、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3和Bax水平升高。然而，利拉鲁肽的给药逆转了这些改变。这些发现表明，利拉鲁肽可能通过增加自噬和抑制凋亡来改善慢性应激的有害影响。
慢性应激会导致小鼠血压、血糖和血脂水平异常，这是心血管疾病的常见影响。高胆固醇血症已被证明参与动脉粥样硬化的发展，而利拉鲁肽治疗可降低血脂水平。此外，一项随机试验发现，利拉鲁肽联合二甲双胍可显著降低总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白效应。Tingli Guo等人的研究表明，利拉鲁肽不仅能缓解高脂饮食引起的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平异常升高，促进胆固醇逆向转运，还能改善肝组织损伤。然而，利拉鲁肽是否对慢性应激诱导的术后再狭窄具有相同作用尚未见报道。因此，我们在手术后第4天和第7天测量了小鼠的血脂、肝TG含量、血糖水平以及血压。对肝组织进行H&E和油红O染色，并检测肝组织中PLIN2和DPP4的蛋白表达水平。结果显示，在慢性应激条件下，利拉鲁肽缓解了慢性应激诱导的肝损伤和脂质沉积，但在显微镜下效果不显著，这可能与建模和给药时间短有关。此外，利拉鲁肽给药可有效降低肝脏中PLIN2和DPP4的蛋白水平，缓解血管损伤小鼠的异常血压和血糖水平；它还降低了血清和肝脏中的甘油三酯水平，但对血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）没有显著影响。这可能是因为血清样本在手术后第四天收集，利拉鲁肽的治疗周期短，可能不足以对这些生化指标产生显著影响。
长期慢性应激不仅会导致多种疾病，还会加速血管衰老。研究表明，利拉鲁肽可以预防SIRT1介导的人视网膜内皮细胞（HRECs）的细胞衰老。自噬与衰老密切相关，其效率随着年龄的增长而下降。自噬中断会加速细胞衰老和死亡，从而促进衰老的发生。为了确定利拉鲁肽是否也具有延缓衰老的作用，我们对小鼠主动脉进行了β-Gal衰老染色。在植入后第14天，主动脉血管表现出强烈的染色和增加的血管衰老迹象。相比之下，接受利拉鲁肽的小鼠显示出衰老迹象减少和阳性染色减少，这表明利拉鲁肽可能具有抗衰老潜力。然而，这方面的研究很少，需要进一步研究来证实。
VSMCs的异常增殖、迁移和凋亡是包括术后再狭窄在内的多种心血管疾病的病理基础。抑制术后再狭窄的理想方法是激活内皮细胞，同时抑制VSMC的异常过度增殖。因此，迫切需要确定再狭窄的分子机制，并开发专门针对VSMCs的靶向疗法。高血糖对VSMCs的影响与PI3K/AKT通路高度相关，而利拉鲁肽可逆转高血糖对VSMC增殖、迁移和凋亡的影响，从而保护VSMCs免受动脉粥样硬化的影响。此外，Jinmi Lee等人的研究表明，利拉鲁肽通过GLP-1R依赖性抑制ERK和JNK信号通路，抑制Ang II处理的VSMCs的增殖和迁移，并降低增殖标志物PCNA和CCND1的表达。为了阐明利拉鲁肽对VSMCs的影响，我们在本研究中进行了体外实验。结果表明，利拉鲁肽抑制血管平滑肌细胞的增殖、迁移、凋亡并促进自噬，而当自噬抑制剂3-MA存在时，凋亡率增加，自噬相关蛋白受到抑制，这表明利拉鲁肽可通过恢复自噬来缓解凋亡。这些差异具有统计学意义，表明利拉鲁肽通过促进自噬抑制VSMCs的异常增殖和迁移，并减少凋亡，从而缓解术后再狭窄。
因此，我们得出结论，利拉鲁肽对心血管疾病具有直接的保护作用。我们的研究结果表明，利拉鲁肽可能通过抑制PI3K-mTOR通路、恢复自噬、抑制VSMCs的过度增殖和迁移以及调节凋亡来缓解术后再狭窄，从而减缓内膜增生。尽管还需要进一步的研究，但我们的数据表明，利拉鲁肽不仅对于治疗2型糖尿病和肥胖症具有广阔前景，而且对于有心血管疾病风险的老年人的心血管管理也具有潜力。具体来说，利拉鲁肽可以缓解慢性应激和血管衰老加剧的内膜增生。
结论
总之，利拉鲁肽可抑制PI3K/mTOR信号通路，激活自噬，抑制VSMCs的增殖和迁移，减少凋亡，延缓新生内膜形成，从而促进血管损伤修复。此外，利拉鲁肽可减轻肝脏中自噬相关损伤，并减轻慢性应激造成的损害。此外，利拉鲁肽能有效缓解慢性应激诱导的血管衰老，使血脂水平正常化，从而增强心血管健康。利拉鲁肽不仅是一种有效的降糖药，而且对心血管疾病患者，如同时患有糖尿病和高脂血症的患者以及有术后再狭窄风险的患者，具有显著的治疗潜力。
