《Plant Physiology and Biochemistry》：Targeted disruption of a cell wall-modifying gene
α-Mannosidase using CRISPR-Cas9 enhances post-harvest shelf life in tomato through ABA accumulation
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本研究针对番茄采后软化快、货架期短导致巨大经济损失的产业难题，研究人员聚焦细胞壁修饰关键酶α-甘露糖苷酶(α-Man)，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建番茄α-Man基因敲除株系。研究发现，敲除株系果实硬度显著增强，采后35天仍保持良好商品性，其保鲜机制与脱落酸(ABA)含量异常积累、活性氧(ROS)水平降低及细胞壁降解相关基因（如SlPG2a、SlTBG4/5）和乙烯合成信号通路基因（如SlACS2/4、SlACO1/5）的广泛下调密切相关。该研究为通过精准基因编辑改良果实采后品质提供了新策略。
番茄是全球范围内广泛消费且经济价值巨大的作物，但其果实采后极易软化变质，导致惊人的食物浪费和经济损失。这种快速的品质劣化与果实成熟过程中复杂的生理生化变化密切相关，其中细胞壁结构的降解是导致果实软化的核心环节。α-甘露糖苷酶(α-Mannosidase, α-Man)作为一种N-聚糖加工酶，在番茄果实软化过程中扮演着重要角色，但其精确的调控功能和作为延长货架期遗传改良靶点的潜力尚待深入探索。在此背景下，研究人员在《Plant Physiology and Biochemistry》上发表了最新研究成果，利用前沿的CRISPR-Cas9基因编辑技术，揭示了靶向敲除α-Man基因如何通过调控激素平衡和氧化应激状态，显著延长番茄果实的采后寿命。
为开展本研究，研究人员选用了番茄栽培种‘Pusa Ruby’作为实验材料。研究的关键技术方法包括：利用生物信息学工具设计并构建靶向α-Man基因的CRISPR-Cas9载体，通过农杆菌介导法获得转基因番茄植株；采用Sanger测序进行基因型鉴定和脱靶效应分析；运用实时定量PCR(qRT-PCR)分析基因表达谱；通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定植物激素脱落酸(ABA)含量；利用组织切片和显微观察评估果实果皮细胞结构完整性；并系统测定了果实硬度、生理失水率以及氧化应激指标（如H2O2、MDA含量和DPPH自由基清除能力）。
表达模式分析揭示α-Man在果实成熟中的潜在作用
研究人员首先分析了α-Man在番茄果实不同发育和成熟阶段的表达模式。发现其表达量从开花后0天开始逐渐增加，在成熟绿和转色期达到峰值，随后在粉红期、浅红期和红熟期下降。该基因在果皮组织中表达最高，而在营养组织中表达水平很低，表明α-Man在果实成熟过程中可能发挥特异性调控作用。
成功鉴定α-Man基因敲除株系
通过CRISPR/Cas9系统靶向编辑α-Man基因的第一个外显子，研究人员获得了三个纯合突变株系。测序分析证实这些株系引入了移码突变，导致产生严重截短的、无功能的α-Man蛋白。qRT-PCR分析显示，在转色期，突变株系中α-Man的转录本水平降低了91%至99%，证明成功实现了基因敲除。
α-Man敲除导致果实硬度增加和货架期延长
田间表型观察发现，α-Man敲除果实的成熟启动时间与野生型无异，但其采后硬度显著高于野生型。货架期实验表明，野生型果实储存10-15天后开始变质，而敲除果实储存35天后仍无明显 deterioration 迹象。同时，敲除果实的生理失水率显著降低，表明其具有更好的保水能力。
α-Man敲除保持果皮细胞结构完整性
组织学分析显示，储存15天后，野生型果实的果皮细胞出现严重降解、萎缩，细胞间层溶解，三细胞连接点结构被破坏。相比之下，α-Man敲除果实的果皮细胞仍保持完整、饱满的形态，细胞间连接紧密，细胞壁结构完好，这为果实硬度的维持提供了细胞学基础。
多个成熟相关基因转录水平在α-Man敲除果实中下调
分子机制研究表明，α-Man敲除导致一系列成熟相关基因的表达显著下调。这包括细胞壁修饰酶基因（如多聚半乳糖醛酸酶SlPG2a、番茄β-半乳糖苷酶SlTBG4/5、内木葡聚糖转移酶SlEXET）、乙烯生物合成基因（SlACS2/4、SlACO1/5）、乙烯信号转录因子（SlERF1、SlER1、SlERT1B）以及成熟核心调控因子SlRIN。这种广泛的转录重编程可能是果实软化延迟的主要原因。
α-Man敲除果实中ABA积累增加与货架期延长相关
激素检测发现，α-Man敲除果实在采后储存的各个阶段（0、10、20天）均表现出显著高于野生型的ABA含量。进一步分析表明，ABA含量的升高可能源于其合成关键基因SlNCED1的上调，以及降解关键基因CYP707A家族成员（SlCYP707A1/2/3/4）的剧烈下调。而ABA信号通路的核心组分（如受体基因SlPYL1/6和激酶基因SlSnRK2.3/4）的表达未发生显著变化。
α-Man敲除调控果实氧化应激参数
生化分析显示，α-Man敲除果实中的过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量显著低于野生型，表明其氧化损伤程度较轻。同时，其DPPH自由基清除能力在储存后期显著增强，反映出总抗氧化能力的提升。这种改善的氧化稳态可能与高水平的ABA所激发的抗氧化防御系统有关。
α-Man敲除具有高度特异性且不影响植物正常生长发育
脱靶效应分析证实，CRISPR/Cas9系统对α-Man的编辑是高度特异性的，在预测的潜在脱靶位点未检测到突变。此外，对敲除植株的详细表型分析表明，其营养生长（株高、茎粗、叶片数等）、开花时间、果实基本形态（单果重、果径、种子数）和品质指标（可溶性固形物含量、类胡萝卜素含量）与野生型相比均无显著差异，证明α-Man的敲除在改善采后品质的同时，未对植物的正常生长发育产生不利影响。
综上所述，本研究通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，成功揭示了α-甘露糖苷酶在番茄果实采后保鲜中的关键负调控作用。敲除α-Man基因通过破坏N-聚糖介导的成熟正反馈环路，导致核心转录因子SlRIN的表达下调，进而广泛抑制了细胞壁降解和乙烯信号通路相关基因的表达。同时，该敲除触发了ABA的异常积累和氧化应激耐受性的增强。这些协同作用最终使得果实细胞壁结构得以保持，软化进程延迟，货架期显著延长。该研究不仅深化了对果实成熟软化分子机制的理解，更重要的是，鉴定出α-Man作为一个能够显著延长番茄采后寿命且不影响正常生长发育的理想遗传改良靶点，为通过精准育种减少采后损失提供了具有重要应用前景的新策略。
