超声辅助优化桦革裥菌提取物：响应面法与人工神经网络-遗传算法对酚类含量及生物活性的增强作用对比研究

《Scientific Reports》：Phenolic content and biological activities of Lenzites betulina extracts obtained by ultrasonic-assisted optimization approaches

本研究针对如何高效提取药用真菌桦革裥菌（Lenzites betulina）中的生物活性成分这一关键问题，采用响应面法（RSM）和人工神经网络-遗传算法（ANN-GA）两种优化策略，系统优化了超声辅助提取工艺参数（温度、时间、溶剂比例）。研究结果表明，RSM优化提取物在酚类化合物含量、抗氧化活性（DPPH、FRAP、TAS、TOS、OSI）、乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）抑制活性以及对人肺癌（A549）、乳腺癌（MCF-7）和前列腺癌（DU-145）细胞的抗增殖活性方面均显著优于ANN-GA优化提取物。该研究为最大化药用真菌的生物活性提供了一种有效的提取优化策略，并凸显了桦革裥菌在制药、营养保健品和生物技术领域的应用潜力。

　　

在天然产物研究领域，药用真菌因其丰富的生物活性成分而备受关注，其中桦革裥菌（Lenzites betulina）作为一种引起白腐的木材分解真菌，近年来被发现在抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血糖等方面具有显著潜力。然而，真菌提取物的生物活性高度依赖于提取工艺参数，不恰当的提取条件可能导致热敏性活性成分的降解或氧化，从而影响其最终功效。因此，如何通过精确优化提取条件来最大化药用真菌的生物活性，成为当前研究的关键问题。传统优化方法往往难以全面捕捉多个参数间的复杂交互作用，而响应面法（RSM）和人工智能辅助优化方法（如人工神经网络-遗传算法，ANN-GA）为这一挑战提供了新的解决思路。发表在《Scientific Reports》上的这项研究，正是系统比较了RSM和ANN-GA两种策略在优化桦革裥菌超声辅助提取过程中的表现，旨在确定哪种方法能更有效地提升提取物的酚类含量及多种生物活性。

为开展研究，作者首先在土耳其伊斯坦堡的贝尔格莱德森林采集了桦革裥菌样本，并经形态学鉴定后保存。研究核心是优化超声辅助提取工艺。作者设计了27种不同的提取条件组合，变量包括提取温度（30、45、60 °C）、时间（30、45、60分钟）和乙醇/水溶剂比例（0%、50%、100%）。以总抗氧化状态（TAS）作为关键响应指标，分别建立了RSM二次回归模型和ANN-GA（3-3-1网络结构）预测模型来确定最优提取参数。随后，在两种模型确定的最优条件下（RSM: 38.95 °C, 38.89分钟, 69.53%乙醇；ANN-GA: 45.97 °C, 48.38分钟, 73.33%乙醇）制备提取物，并系统评估其生物活性。评估内容包括：抗氧化能力（DPPH自由基清除、FRAP铁离子还原能力、TAS、总氧化状态TOS及氧化应激指数OSI）、抗胆碱酯酶活性（对AChE和BChE的半抑制浓度IC₅₀）、体外抗增殖活性（对A549、MCF-7、DU-145癌细胞系的抑制率）以及酚类化合物含量（通过LC-MS/MS定量分析7种主要酚类物质）。

优化提取条件

研究结果显示，提取参数对T值有显著影响。在45°C、45分钟、50%乙醇/水比例的组合下获得了最高TAS值（8.045 ± 0.015 mmol/L）。RSM二次模型对实验数据拟合良好（R2 = 0.961），能有效预测TAS响应。ANN-GA模型也表现出高预测精度（MSE = 0.009, R = 0.991）。两种优化方法确定的最优条件在具体参数上存在差异，这为后续生物活性的对比奠定了基础。

抗氧化活性

对两种优化提取物的抗氧化活性评估表明，RSM优化提取物在所有测试指标上均显著优于ANN-GA优化提取物。其DPPH自由基清除能力（128.030 ± 1.981 mg TE/g）和FRAP铁离子还原能力（217.550 ± 3.216 mg TE/g）更高，总抗氧化状态TAS（8.175 ± 0.062 mmol/L）更强，同时总氧化状态TOS（7.139 ± 0.070 μmol/L）和氧化应激指数OSI（0.087 ± 0.001）更低。这表明RSM优化条件更能促进抗氧化成分的溶出并维持其稳定性。

抗胆碱酯酶活性

在抗胆碱酯酶活性方面，虽然两种提取物的IC₅₀值均高于阳性对照加兰他敏，表明抑制效力较弱，但RSM优化提取物对AChE（IC₅₀= 61.530 ± 1.931 μg/mL）和BChE（IC₅₀= 89.603 ± 1.305 μg/mL）的抑制活性均显著强于ANN-GA优化提取物。这表明RSM优化条件更有利于保留或增强具有胆碱酯酶抑制活性的成分。

抗增殖活性

抗增殖实验结果显示，两种提取物在25-200 μg/mL浓度范围内对三种癌细胞系（A549, MCF-7, DU-145）均表现出剂量依赖性的增殖抑制效果，且在最高浓度（200 μg/mL）下抑制效果最为显著。在所有测试浓度和细胞系中，RSM优化提取物的抑制率均高于ANN-GA优化提取物，进一步证实了RSM优化策略在增强抗肿瘤潜力方面的优势。

酚类含量

LC-MS/MS分析揭示了两种提取物酚类成分的显著差异。RSM优化提取物中所有检测到的7种主要酚类化合物（包括没食子酸、原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、咖啡酸、槲皮素、儿茶素水合物、香草酸）的含量均显著高于ANN-GA优化提取物。特别是没食子酸含量，RSM提取物（10218.837 ± 4.511 mg/kg）远高于ANN-GA提取物（6364.240 ± 5.294 mg/kg）。这直接解释了RSM提取物为何在所有生物活性测试中表现更优，因为酚类化合物是这些活性的主要物质基础。

本研究通过系统比较RSM和ANN-GA两种优化策略，得出结论：虽然ANN-GA在建模复杂系统非线性关系方面具有优势，但RSM在优化桦革裥菌超声辅助提取工艺方面表现更佳。RSM优化获得的提取物具有更高的酚类化合物含量，并因此展现出更强的抗氧化、抗胆碱酯酶和抗增殖活性。这表明，在追求最大化药用真菌生物活性的提取优化过程中，RSM提供的参数组合能更好地平衡提取效率与生物活性成分的稳定性。研究成果不仅证实了桦革裥菌是一种富含生物活性成分的宝贵资源，更重要的是强调了提取工艺优化策略的选择对其最终应用效果的决定性影响。该研究为高效开发利用药用真菌资源提供了重要的方法学参考和实践依据，对其在功能性食品、药品及生物技术领域的应用开发具有积极的推动作用。研究也指出，未来可探索RSM与人工智能模型相结合的混合优化策略，以期在更复杂的生物系统中取得更优的平衡。