《Bioactive Materials》：Esophagus extracellular matrix with microenvironmental complexity for esophageal organoids
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本研究针对传统Matrigel（MAT）基质因肿瘤来源限制其临床应用的问题，开发了猪食管源性脱细胞细胞外基质（EEM）水凝胶。研究证实EEM具有良好的生物相容性，其蛋白质组学特征富含食管特异性蛋白，能更好地模拟食管微环境。利用EEM培养的食管类器官可长期扩增并表达食管相关基因，将其移植至小鼠食管溃疡模型可显著促进上皮再生并减轻纤维化。该研究为食管类器官的临床应用提供了一种稳定、可再生的新型基质材料，具有重要的转化医学价值。
食管是消化系统的重要组成部分，负责将食物输送至胃部。然而，食管溃疡等黏膜损伤疾病，以及食管癌内镜黏膜下剥离术（ESD）后的黏膜缺损，常常导致食管狭窄，而食管自身的有限再生能力使得修复过程充满挑战。因此，开发有效的细胞疗法用于食管重建具有巨大的临床需求。在众多策略中，三维（3D）类器官技术展现出作为再生医学强大工具的潜力。食管类器官因其包含增殖性基底细胞和分化细胞，并能长期扩增，在食管上皮再生方面具有独特优势。然而，其临床应用仍处于探索阶段，一个关键的瓶颈在于类器官培养所依赖的基质胶（Matrigel, MAT）。MAT作为一种肿瘤来源的基质，其潜在的免疫原性和批次间差异严重阻碍了类器官疗法向临床的转化。因此，开发一种能够模拟食管微环境复杂性、具有高生物相容性且成分明确的培养基质，对于推动食管类器官的应用至关重要。脱细胞技术能够保留组织原有的细胞外基质（ECM）成分和结构，为构建理想的生物支架提供了可能。脱细胞食管基质（Esophagus-derived extracellular matrix, EEM）理论上能提供丰富的食管特异性ECM信号，但其在类器官培养和移植中的应用尚未得到充分探索。
针对上述问题，发表在《Bioactive Materials》上的一项研究提出了一种创新的解决方案。研究人员旨在开发一种基于脱细胞食管基质（EEM）的水凝胶，用于食管类器官的培养和移植，以替代传统的MAT。他们系统地评估了EEM的生物学特性、蛋白质组学特征、支持类器官生长和分化的能力，以及其在动物模型中的治疗功效。
为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：首先，采用改良的脱细胞方案处理猪食管组织，制备EEM，并对其进行组织学、生化（DNA、GAG、胶原含量）和力学性能（流变学）表征。其次，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行深入的蛋白质组学分析，比较EEM与MAT以及不同器官来源脱细胞基质的蛋白质组成。再者，建立了小鼠食管类器官的三维培养体系，分别在EEM水凝胶和MAT中培养，并通过实时定量PCR（qRT-PCR）、免疫荧光染色和活死染色评估类器官的形成效率、基因表达、形态结构和活性。最后，构建了小鼠乙酸诱导的食管溃疡模型，将EEM包裹的食管类器官移植到损伤部位，通过组织学染色（H&E、Masson's trichrome）、免疫荧光标记（追踪移植细胞）和蛋白质组学分析，系统评估移植后的上皮再生、纤维化缓解情况及分子机制。
3.1. EEM的制备与表征
研究人员成功地对猪食管组织进行了脱细胞处理，得到的EEM去除了99.78%的DNA，残留DNA含量符合临床应用标准（<50 ng/mg干重），同时保留了糖胺聚糖（GAG）和可溶性胶原等主要ECM成分。组织学染色（H&E, MT, AB）证实细胞成分被有效清除，而ECM结构得以保留。EEM经胃蛋白酶消化和中和后，可在37°C下形成具有纳米纤维网络结构的水凝胶。流变学分析表明，不同浓度（1-7 mg/mL）的EEM水凝胶均表现出稳定的凝胶特性，其弹性模量随浓度增加而升高。选择5 mg/mL作为后续实验的优化浓度。
3.2. EEM的体外和体内生物相容性
生物安全性评估显示，EEM水凝胶的内毒素水平低于FDA对植入式医疗器械的限值。与小鼠巨噬细胞RAW 264.7共培养实验表明，EEM不会诱导促炎细胞因子（TNF-α, IL-6）的分泌增加。小鼠皮下注射EEM水凝胶后，注射部位未见明显的组织损伤或过度炎症细胞浸润。注射10天后，主要器官重量、组织学形态、血常规和血清生化指标均与正常小鼠无显著差异，证明了EEM具有高度的生物相容性。
3.3. EEM的蛋白质组学分析
蛋白质组学分析揭示了EEM与MAT的显著差异。在EEM中鉴定出的527种蛋白质中，有392种（74.38%）为EEM所特有。EEM中基质体（Matrisome）蛋白占蛋白总丰度的17.95%，其核心基质体蛋白（胶原、蛋白聚糖、糖蛋白）的组成比MAT更为多样，且更接近成人食管组织的蛋白组成。尤为重要的是，EEM中含有53种在食管中高表达的蛋白质（esophagus-elevated proteins），而MAT中则没有。基因本体（GO）富集分析显示，这些食管高表达蛋白主要参与角质形成细胞分化、表皮发育等生物学过程。此外，研究还证实了不同批次和不同供体来源的EEM样品在蛋白质组成上具有高度的一致性和可重复性。
3.4. EEM水凝胶作为食管类器官的培养基质
在优化的5 mg/mL EEM水凝胶中培养的食管类器官，其形态与在MAT中培养的类器官相似，呈致密球状。虽然EEM中的类器官形成效率略低于MAT，但qRT-PCR分析显示，类器官中食管基底层标志物（Krt14）和棘上层标志物（Krt13, Krt4）的基因表达水平相当或更高。免疫荧光染色进一步证实，EEM中生长的类器官能够很好地重演食管上皮的分层结构：外层表达基底细胞标志物（CK14, SOX2, p63）和增殖标志物（Ki67），内层表达分化相关的棘上层标志物（CK13, CK4），并具有细胞角化特征。类器官在EEM中能够稳定传代培养超过6代（约80天），并保持其特性和基因表达。与其他器官（如胃、肠、肝、肺、心、肾）来源的脱细胞基质相比，EEM在促进食管类器官特异性角蛋白表达方面表现出最优效果，体现了其组织特异性优势。研究还发现，EEM预凝胶溶液在4°C或-80°C下储存不同时间（最长2年）后，其形成的水凝胶仍能有效支持食管类器官的生长和分化，表明EEM具有良好的储存稳定性，便于实际应用。
3.5. 利用EEM水凝胶移植食管类器官促进上皮再生
为了评估治疗潜力，研究人员将EEM包裹的食管类器官移植到乙酸诱导的小鼠食管溃疡模型中。结果显示，移植的类器官（通过DiI或EGFP标记追踪）能够在损伤部位存活并整合到再生的上皮中。与仅注射生理盐水（Saline）的对照组相比，类器官移植组（EO + EEM）小鼠的体重恢复更快。组织学分析表明，移植组在术后第3天即表现出更短的上皮缺损长度，提示上皮再生加速。术后第10天，虽然两组上皮均已基本再生，但移植组的基底细胞层（CK5+区域）更厚，且纤维化面积（通过Masson's trichrome染色评估）显著减小。α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）免疫染色进一步证实，移植组在术后第3天肌成纤维细胞活化程度较低，表明纤维化过程得到缓解。这些效果被证明主要由类器官本身介导，而非单纯由水凝胶载体引起。
3.6. 移植后分子机制的蛋白质组学洞察
对术后第3天食管组织进行的蛋白质组学分析为再生机制提供了分子层面的解释。与Saline组相比，EO + EEM组中有许多蛋白质表达上调。GO和Reactome通路富集分析显示，这些差异表达蛋白显著富集于与伤口愈合相关的生物学过程和通路，包括“炎症反应”、“防御反应”、“伤口反应调控”、“中性粒细胞脱颗粒”、“补体级联调控”和“血小板脱颗粒”等。与“伤口愈合”、“组织再生”和“吞噬作用”等特定功能相关的蛋白在EO + EEM组中也呈现高表达趋势。此外，一些与PI3K/Akt、MAPK等经典再生信号通路相关的蛋白（如GNB1、COL1A1、THBS1等）在移植组表达升高。这些结果表明，EEM包裹的食管类器官移植通过激活一系列协调的伤口愈合和免疫调节过程，促进了组织的修复与再生。
本研究成功开发并系统验证了一种基于猪食管源性脱细胞基质（EEM）的新型水凝胶平台。该平台不仅具有良好的生物安全性和生物相容性，其独特的蛋白质组学特征更能精准模拟食管微环境，为食管类器官提供了优于传统MAT基质的培养条件。EEM支持类器官的长期扩增并维持其食管上皮特性。更重要的是，将EEM与食管类器官结合用于移植，在小鼠食管溃疡模型中展现出显著的治疗效果，包括促进上皮再生和减轻纤维化。蛋白质组学分析揭示了移植后伤口愈合相关通路被激活，从分子层面阐释了其促进再生的机制。这项研究的意义在于，它为解决MAT的临床转化瓶颈提供了一个安全、有效且可再生的替代方案，为推进食管类器官在疾病建模、药物筛选乃至最终临床细胞治疗中的应用奠定了坚实的基础。EEM平台的成功构建，标志着向实现食管再生医学的临床转化迈出了关键一步。
