TLR7/8激动剂R848与多柔比星对4T1乳腺癌细胞免疫检查点调控及凋亡作用的比较研究

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Comparative effects of a TLR7/8 agonist and doxorubicin on immune checkpoint modulation and apoptosis in 4T1 breast cancer cells

本研究探讨了TLR7/8激动剂R848与化疗药物多柔比星（DOX）对4T1乳腺癌细胞的直接作用。结果显示，DOX有效诱导细胞死亡但显著上调PD-L1和PVR等免疫检查点分子表达，可能促进免疫逃逸；而R848虽细胞毒性较弱，却能诱导早期凋亡且不增加检查点配体表达，为乳腺癌免疫治疗提供了新思路。

　　

尽管诊断技术和新型疗法取得了飞速且显著的进步，乳腺癌仍然是医学科学面临的挑战之一。这种复杂的疾病包含不同的亚型，在女性中尤为普遍，占该人群所有癌症病例的近三分之一，确诊患者的死亡率约为15%。传统的治疗策略，如乳腺肿瘤消融疗法、内分泌疗法、化疗、放疗和免疫检查点抑制剂，大多伴随着广泛的副作用。近年来，免疫疗法已成为一种有前景的癌症治疗方法，它利用人体免疫系统来寻找并根除肿瘤细胞，并已成为许多癌症类型的标准治疗手段。然而，免疫疗法也面临挑战，例如肿瘤细胞可以通过上调程序性死亡配体1（PD-L1）、PD-L2、脊髓灰质炎病毒受体（PVR；CD155）和半乳糖凝集素-9（Gal-9）等免疫检查点配体来规避宿主免疫反应。

在此背景下，调节乳腺癌肿瘤免疫组成和功能的一种可行方法是抑制肿瘤促进性炎症信号通路，例如Toll样受体（TLRs）。TLR激动剂不仅可改变肿瘤微环境中髓系细胞的活性，还能增强适应性免疫的活性和特异性。其中，TLR-3、TLR-6、TLR7/8和TLR-9激动剂被认为是乳腺癌治疗中最有希望的免疫治疗剂之一。它们通过刺激免疫反应间接产生抗肿瘤效应，或通过直接促进肿瘤细胞增殖和细胞毒性发挥作用。本研究旨在探讨TLR7/8激动剂（R848）的直接作用，并将其与化疗药物多柔比星（Doxorubicin, DOX）在细胞毒性作用以及对乳腺癌细胞表面检查点分子调节作用方面进行比较。该研究发表于《Biochemistry and Biophysics Reports》。

为开展研究，研究人员主要应用了几项关键技术。他们使用了小鼠乳腺癌细胞系4T1作为研究模型。通过MTT法检测了R848和DOX处理48小时后对4T1细胞活力的影响，并计算了半数抑制浓度（IC₅₀）。利用定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析了PD-L1、Galectin-9和PVR基因的mRNA相对表达水平，以HPRT作为内参基因。通过 Annexin V/PI 双染法进行流式细胞术检测，评估了药物诱导的细胞凋亡情况。此外，还采用划痕实验评估了药物对4T1细胞迁移能力的影响。

3.1. R848和DOX处理后4T1乳腺癌细胞的细胞活力

研究结果显示，4T1细胞在分别用浓度递增的R848和DOX处理24和48小时后，细胞活力呈剂量依赖性下降。48小时处理的效果优于24小时处理。计算得出R848和DOX的IC₅₀值分别为91 μM和1 μM，表明DOX的细胞毒性强于R848。

3.2. R848和DOX处理后4T1乳腺癌细胞上免疫检查点配体的表达

通过qRT-PCR评估关键免疫检查点分子的基因表达发现，DOX处理组的PD-L1基因表达水平相较于对照组和R848处理组均显著升高。DOX处理组的PVR基因表达水平仅与R848处理组相比有显著差异，而R848处理组的PVR表达水平相较于对照组有下降趋势，但不显著。Gal-9基因的表达水平在三组间无显著差异，但DOX处理使其表达略有升高，而R848处理使其略有降低。

3.3. R848和DOX处理后4T1乳腺癌细胞的凋亡评估

细胞凋亡检测表明，R848显著增加了早期凋亡细胞的比例，其效果优于DOX处理组和对照组。在晚期凋亡/坏死参数上，DOX处理组相较于对照组显著增加，R848处理组也有所增加。两组药物的总细胞死亡率均显著高于对照组，其中DOX的效果尤为强烈。

3.4. R848和DOX处理后4T1乳腺癌细胞的迁移评估

划痕实验结果显示，在划痕后24小时，对照组4T1细胞显示出约50%的伤口闭合，R848处理将其降低至约35%，而DOX则将其降低至10%以下。到了48小时，对照组和R848处理组的伤口几乎完全闭合，两者无显著差异，而DOX处理组的迁移率仍然极低（约5-8%），显著低于另外两组。这表明R848对细胞迁移的抑制作用是暂时的，而DOX则能产生持久且强烈的抑制效果。

本研究结论指出，R848和DOX均对4T1细胞具有抗增殖和促凋亡作用，但作用机制和影响不同。DOX能有效诱导细胞死亡，但同时显著上调PD-L1和PVR等免疫检查点分子的表达，这可能潜在地促进免疫逃逸。相比之下，R848虽细胞毒性较弱，但能诱导早期凋亡，且不会增加检查点配体的表达。这些发现强调了细胞毒性药物与免疫调节药物联合使用的潜力。讨论部分进一步阐释，DOX诱导的PD-L1和PVR上调可能与细胞应激生存程序有关，这虽然增强了细胞毒性，但也可能带来免疫抑制风险。而R848作为一种TLR7/8激动剂，其免疫刺激特性可能通过激活先天免疫通路诱导凋亡，而不引发强烈的检查点分子上调。该研究为理解不同药物在直接抗肿瘤效应和免疫调节方面的差异提供了重要见解，并为后续开展体内研究以及探索R848与DOX或其他免疫疗法的联合应用策略奠定了理论基础。研究也指出了局限性，如仅在体外进行，未验证蛋白水平功能，以及潜在分子机制尚不明确等，这些都是未来研究的方向。