《Fish & Shellfish Immunology》：Oral vaccination via virus-like particles encapsulated in
Lactococcus lactis
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利用乳酸乳球菌表达神经坏死病毒（NNV）衣壳蛋白组装成病毒样颗粒（VLPs），并评估其作为口服疫苗的效力。结果显示，氯酸钠灭活L. lactis细胞包裹的VLPs在口服免疫中诱导出更高的中和抗体效价（较纯化VLPs提高2倍）和显著降低脑部病毒载量（约2.5个对数）。该策略为水产养殖提供了一种高效、低成本的口服免疫方案。
许怡红|李青培·卡门|潘宣芝|林欣颖|黄志伟|陈简琳|穆坎·普拉巴卡兰|杨大文
新加坡国立大学生物科学系，科学大道14号4单元，117543，新加坡
摘要
神经坏死病毒（NNV）会导致海洋鱼类严重疾病，导致高死亡率和水产养殖业重大经济损失。迫切需要有效的口服疫苗，以实现大规模、高效的人工免疫。在本研究中，NNV衣壳蛋白成功地在乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中表达，并作为疫苗候选物在亚洲海鲈（Lates calcarifer）幼鱼中进行了评估。该衣壳蛋白组装成了类似病毒的颗粒（VLPs），其结构与在大肠杆菌（E. coli）中产生的相似。纯化的VLPs腹腔注射后引发了强烈的体液免疫反应，尽管抗原剂量减少了十倍，但NNV特异性IgM滴度仍比口服给药高出四倍。然而，将VLPs包封在活的或热灭活的乳酸乳球菌细胞中后，通过口服给药未能诱导出保护性免疫，这可能是由于抗原释放不良所致。相比之下，用次氯酸钠灭活的乳酸乳球菌保持了VLPs的包封性、溶解性和结构完整性，用这些细胞进行口服接种后产生的抗体和中和滴度比纯化的VLPs高出约两倍。挑战实验表明，在接种后7天，脑部的病毒载量显著降低了约2.5个对数级。总体而言，这些发现表明用次氯酸钠灭活的乳酸乳球菌是一个有前景的口服疫苗平台，为水产养殖中的NNV免疫提供了一种可持续策略。
引言
在鱼类养殖业中，病毒感染是一个严重问题，由于缺乏简单有效的处理感染鱼类的方法，导致产量下降和重大经济损失。其中，由神经坏死病毒（NNV）引起的神经坏死（VNN）是影响经济重要鱼类物种（如石斑鱼、欧洲海鲈和亚洲海鲈）的主要破坏性疾病之一[1]。鱼类在幼体和幼年期尤其容易感染，该疾病在幼体阶段的死亡率接近100%。此外，即使一些鱼存活下来，其生长也会受到抑制。目前尚无简单有效的治疗方法来治疗NNV感染，因此通过疫苗进行预防是最有前景的策略。
疫苗在控制和预防鱼类传染病方面发挥着越来越重要的作用。已经开发了几种针对欧洲海鲈和石斑鱼的NNV原型疫苗，包括灭活的NNV[2]、减毒活NNV[3,4]、类病毒颗粒（VLPs）[5],[6],[7],[8],[9]、重组衣壳蛋白[3,[10],[11],[12],[13]、DNA疫苗[14]以及从NNV衣壳衍生的合成肽[15,16]。其中，只有两种针对欧洲海鲈的灭活疫苗已上市，适用于相对较大的鱼（≥12克）。大多数疫苗制剂，包括商业产品，都依赖于注射给药。注射是一种将抗原输送到免疫系统的有效方法。然而，这种方法只能用于体型较大的鱼，会对鱼造成压力，在注射部位造成损伤，并且需要大量劳动力[17]。尽管已经开发了自动化注射方法以降低劳动力成本，但这些方法往往会增加注射引起的损伤。此外，由于幼鱼体型较小，注射接种不可行。因此，在这些鱼能够接受注射接种之前，未接种疫苗的鱼可能会发生病毒感染。此外，孵化场饲养的幼体和幼鱼因NNV导致的死亡率可能达到种群的100%。因此，开发其他疫苗输送途径（如口服和浸泡接种）对于海鲈和石斑鱼养殖至关重要。
口服接种适用于任何发育阶段的鱼类。它不会对鱼造成压力，成本低廉，操作简单，无需处理单个鱼。最后，口服疫苗可以在养殖鱼的整个生命周期内反复接种。尽管有这些优点，但口服疫苗的效果仍显著低于注射接种[17,18]。为了达到与注射接种相同的存活率，通过口服途径免疫石斑鱼幼鱼所需的NNV VLPs剂量约为肌肉注射的80倍[5]。这种低效率主要是由于抗原（例如衣壳蛋白）在恶劣的胃环境（pH值低且消化酶浓度高）中的变性和降解[19]。为了减少抗原的变性和降解，已经使用活的桡足类动物（Artemia）作为鱼饲料，将表达NNV衣壳蛋白或其变体的大肠杆菌细胞包封起来，并通过口服方式输送抗原[13,20]。研究表明，以这种方式输送的NNV抗原能够有效预防石斑鱼幼鱼的NNV感染。另一项研究显示，可以利用表达NNV衣壳蛋白的大肠杆菌细胞作为疫苗载体来包封和输送NNV衣壳蛋白。用这种饲料接种的欧洲海鲈能够抵抗NNV感染[11]。然而，使用大肠杆菌作为疫苗载体引发了生物安全方面的担忧，限制了其作为口服疫苗的实际应用。
在本研究中，我们使用可食用的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）作为抗原表达和载体系统，开发了一种针对NNV的口服疫苗。通过DNA克隆技术，生成了在细胞质中表达NNV衣壳蛋白的重组乳酸乳球菌细胞。表达的衣壳蛋白能够在细胞内自组装成VLPs。通过将这些细胞加入鱼饲料中，实现了衣壳蛋白的口服输送。活的重组乳酸乳球菌细胞和热灭活的细胞在亚洲海鲈体内未诱导出中和抗体。另一方面，用次氯酸钠灭活的乳酸乳球菌细胞在相同抗原剂量下诱导出的中和抗体显著高于纯化的VLPs。此外，用含有NNV VLPs的次氯酸钠灭活乳酸乳球菌细胞进行口服接种的欧洲海鲈幼鱼，在NNV感染后第7天的脑部病毒滴度降低了约2.5个对数级。
细胞系和病毒
SB细胞系（CVCL_VK76）来源于亚洲海鲈（Lates calcarifer）幼鱼的成纤维细胞[21]，在含有10%胎牛血清（FBS，GIBCO，美国）和1×抗生素-抗真菌剂（Gibco，美国）的Leibovitz L-15培养基中于28°C培养。
本研究使用了Greasy grouper NNV（GGNNV），它是红斑石斑鱼NNV（RGNNV）基因型的代表，其GeneBank（GB）登录号为RNA1（AF319555）和RNA2（AF318942），之前已经获得[22]。
在乳酸乳球菌（L. lactis）中表达和表征NNV VLPs
在乳酸乳球菌中表达的NNV衣壳蛋白在超声处理后主要存在于可溶性 fraction中（图1）。当将可溶性 fraction应用于Capto Core 400柱时，衣壳蛋白仅在流过部分被检测到，表明衣壳分子组装成了大于400 kDa的寡聚体。需要注意的是，该柱允许分子通过，即使这些分子的表观分子量大于400 kDa。为了观察这些寡聚体的形态...
讨论
我们的研究表明，抗原的输送方式对NNV VLP疫苗在亚洲海鲈中的效果至关重要。正如预期的那样，纯化的VLPs腹腔注射产生了最强的体液免疫反应，IgM滴度约为口服给药组的四倍，尽管口服组的抗原剂量是腹腔注射组的十倍。这一观察结果与众多报告一致，这些报告表明肠外接种可以绕过...
伦理
本研究的动物实验获得了新加坡Temasek生命科学实验室的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（IACUC批准编号TLL(F)-22–011）。
作者贡献声明
许怡红：实验设计和执行、数据分析、撰写——初稿。
李青培·卡门：实验设计和执行。
潘宣芝：实验执行。
林欣颖：实验执行。
黄志伟：实验执行。
陈简琳：实验执行。
穆坎·普拉巴卡兰：概念构思、撰写——审稿与编辑、监督、资金筹集。
杨大文：概念构思、撰写——初稿、审稿与编辑、监督、资金筹集。
资金来源
本研究得到了新加坡食品局在其“新加坡食品故事”（“SFS”）研发计划“第一笔资助Cal”（主题1：可持续城市食品生产）（SFS_RND_SUFP_001_07）的支持。
