《Journal of Neuroscience Methods》：Image segmentation and registration of carp brain tissue slices oriented to brain atlas construction
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鲤鱼脑图谱构建中采用HSI颜色空间多阈值分割算法和形态结构特征点匹配方法实现脑组织切片图像分割与配准，验证了该方法在三维空间定位中的有效性，为脑控机器人运动控制奠定基础。
严艳红|赵阳|彭勇|韩凌军|孙书豪|文玉东|董学英
中国河北省秦皇岛市燕山大学机械工程学院 066004
摘要
背景
脑图谱是提供大脑运动核位置和功能信息的重要工具，而脑组织切片图像的分割和配准是构建脑图谱的必要基础。
新方法
为了构建鲤鱼脑图谱，本研究对鲤鱼脑组织图像的分割和配准进行了研究。采用脑组织标本预固定和石蜡组织切片的方法，并结合鲤鱼脑组织切片的特点，选择了基于HSI颜色空间的多阈值图像分割算法进行图像分割。在图像配准方面，利用鲤鱼不同脑区的形态和结构特征来选择特征点进行图像配准。
结果
研究结果表明，所使用的图像分割和配准算法能够满足实验要求，并符合鲤鱼脑在空间位置上的结构特征。
与现有方法的比较
传统的脑图谱绘制是由人工完成的，耗时且劳动强度大，且仅限于二维显示。图像分割技术可以自动识别脑区的轮廓，节省人力并促进三维重建和数字研究。
引言
生物机器人是一种可以通过控制技术施加干预信号来调节生物行为的装置（Yong等人，2020年）。动物机器人可以应用于环境监测、医疗保健、应急救援和灾害救援、生态研究等多个领域，帮助人类解决问题并降低工作任务的潜在风险（Ce等人，2005年）。在动物机器人控制方面，脑控制技术是最常用的控制方法，通过对脑运动神经核的电刺激来控制动物机器人的相应运动行为。脑图谱是通过染色后的脑组织显微图像来识别大脑中的各种神经核，从而准确提供大脑的结构和功能信息。因此，构建脑图谱是研究生物机器人的重要基础。
自20世纪50年代以来，人类陆续开展了动物脑图谱的研究，目前已有多种动物脑图谱。1960年，Robert和Liu绘制了狗的脑图谱；1963年，K?nig等人研究了Wistar大鼠从前脑到中脑的脑图谱；1963年，Snider和Lee绘制了猴子的脑图谱；1964年，Verhaart等人绘制了猫的脑图谱；1966年，Joseph等人绘制了13线地黄松鼠的脑图谱；1976年，Smeets和Nieuwenhuys绘制了白斑角鲨的脑图谱；1986年，Paxinos和Watson制作了最完整的大鼠脑图谱；1990年，Bischof和Niemann绘制了斑胸草雀的脑图谱；1990年，杨文光完成了中缅树鹊和广西猕猴的脑立体图谱；1994年，薛龙增等人绘制了西吉鹅的脑立体图谱；1999年，陈志红和张宝林绘制了Dauricus松鼠脑干的立体图谱；2002年，刘继武等人完成了北京鸭延髓、小脑、大脑、脑桥和中脑的图谱研究；2009年，马晓乐绘制了甘肃果子狸的脑图谱；2014年，倪荣军研究了树鼩的脑解剖图谱；2016年，Tsukano等人在小鼠冠状脑切片上标记了前听觉场、初级听觉皮层、次级听觉场、背侧前场、背侧内侧视觉场和背侧视觉场六个区域，使现有的大鼠脑图谱更加精确；2017年，Jiang Tianzi团队绘制了人类新的脑图谱。
图像分割和图像配准是脑图谱制作的初步基础工作。图像分割利用图像的某些特征或特征集作为相似性标准，将图像划分为多个不重叠的区域，从而提取、分析和识别出有趣或有意义的特征区域。这是从图像处理到图像分析的必要环节。图像配准是对在不同时间、不同角度和不同条件下拍摄的两张或多张图像进行空间几何变换，使图像中对应位置的像素或体素在几何空间中匹配，从而确定浮动图像与参考图像数据集之间的几何位置关系。通过这种变换关系，可以将浮动图像中的任意点转换为数据图像数据集中的相应坐标系，消除几何空间中浮动图像与参考图像之间的不一致性，这是图像分析和处理的关键环节。
本研究旨在为鲤鱼脑图谱的构建提供基础，研究了脑图谱制作过程中脑组织切片的分割和配准方法，以满足鲤鱼机器人运动控制的需求。通过分析鲤鱼脑组织切片图像的特点，建立了组织形态与颜色信息之间的映射关系。根据组织切片的染色特点，选择了基于HSI颜色空间的多阈值分割方法来分割神经元区域及神经元和神经纤维的混合区域。在图像配准方面，结合脑组织切片图像的特点，选择了基于特征点的配准算法来研究不同脑区的配准；同时使用基于边缘特征点的配准方法对小脑的冠状切片图像进行配准，并用基于边缘特征点的配准方法对间脑、中脑和小脑的冠状切片图像进行配准。这项研究为鲤鱼脑图谱的构建奠定了基础。根据构建的脑图谱，可以准确地将电极植入大脑运动区域，通过对电极施加电刺激来控制鲤鱼机器人的运动。
仪器和试剂
KD-3390冷冻石蜡双用切片机（中国浙江金华Kodi仪器设备有限公司）。BD-60T立体显微镜（中国深圳博仕达光学仪器有限公司）。无水乙醇（中国天津凯通化学试剂有限公司，批号：20211215）。二甲苯（中国天津凯通化学试剂有限公司，批号：20211215）。组织石蜡（中国上海华勇石蜡有限公司）。HE染色试剂盒（中国北京索尔宝科技有限公司）。
获取鲤鱼脑组织切片图像
鲤鱼脑组织切片经过HE染色处理，神经细胞被染成紫红色，神经纤维被染成蓝紫色，因此可以通过颜色差异区分不同的神经区域：紫红色区域为神经元密集区，蓝紫色区域为神经纤维和神经束密集区，粉色区域为混合区域。
讨论
对大脑运动区核团进行电刺激是控制动物机器人产生相应运动行为的主要方法。脑图谱是提供大脑运动核位置和功能信息的重要工具。传统的研究方法是通过手动勾勒每张显微图像的外轮廓和每个内部组织的轮廓，并根据先验知识进行识别。
结论
本研究以鲤鱼为研究对象，采用脑组织标本预固定、石蜡组织切片和HE染色方法制备了鲤鱼脑组织切片的彩色图像。通过对鲤鱼脑组织切片图像进行特征分析，利用颜色差异将不同脑区与不同的颜色特征相对应。对鲤鱼脑组织切片的彩色图像进行分割，并根据亮度差异进行处理。
伦理批准
本研究的所有实验程序均符合国际伦理规范和动物保护法律，并已获得中国燕山大学动物伦理与管理委员会的批准（编号：2022010）。
作者贡献声明
严艳红：撰写 – 原稿撰写、审稿与编辑。彭勇：资金筹集、审稿与编辑。韩凌军：方法学研究。赵阳：数据管理、正式分析。文玉东：监督。孙书豪：概念设计。董学英：项目统筹。
致谢
感谢国家自然科学基金（61573305）和河北省自然科学基金（F2022203038、F2019203511）对本研究的支持。
