发育与早期应激对听觉皮层5-HT3R阳性中间神经元的影响：Htr3a基因在NDNF+与VIP+细胞中的差异性表达及意义

《Neurobiology of Stress》：Developmental and Early-Life Stress-Induced Effects on 5-HT 3R-Expressing Interneurons within Auditory Cortex

本研究聚焦早期生命应激（ELS）如何通过影响听觉皮层（ACx）关键期内表达5-羟色胺3A受体（5-HT3R）的中间神经元（主要包括NDNF+和VIP+细胞），进而导致感觉处理缺陷的机制。研究人员利用多重RNA荧光原位杂交技术，首次系统描绘了Htr3a基因在沙鼠初级听觉皮层NDNF+和VIP+细胞中的发育表达谱，并发现ELS能特异性维持这两种细胞的密度，并上调VIP+细胞中Htr3a mRNA的表达。该研究揭示了5-HT能系统在应激调控皮层可塑性中的新机制，为理解ELS导致神经精神疾病的皮层环路基础提供了重要线索。

　　

在我们生命的最初阶段，大脑如同一块高度可塑的海绵，贪婪地吸收着外界的信息，并据此构建内部世界的模型。这个被称为“关键期”的短暂窗口，是神经环路精细化的黄金时期，但也使其对不良环境因素异常敏感。早期生命应激（Early-Life Stress, ELS），如母婴分离、虐待或忽视，是日后罹患神经精神疾病（如焦虑、抑郁、精神分裂症）的强风险因子。近年来，科学家们发现ELS的魔爪不仅伸向掌管情绪和认知的高级脑区，还直接扰乱了感觉皮层的正常发育。特别是在听觉皮层（Auditory Cortex, ACx），ELS会损害个体对声音时序信息（如短暂间隙、频率调制和声源定位）的处理能力，这种缺陷往往持续终生。

为何应激的阴影会如此深远地投射到听觉感知上？答案可能隐藏在一类特殊的脑细胞——表达5-羟色胺3A受体（5-HT₃A Receptor, 5-HT₃R）的抑制性中间神经元——之中。5-羟色胺（5-HT），又名血清素，是一种重要的神经调质，深度参与应激反应、情绪调节和大脑发育。而5-HT₃R是唯一的5-HT门控离子通道，其激活能快速兴奋神经元。在皮层中，绝大多数表达5-HT₃R的中间神经元可以进一步分为两大主要亚群：主要分布于浅层皮层（L2/3）的血管活性肠肽（Vasoactive Intestinal Peptide, VIP）阳性细胞，和几乎 exclusively 分布于最表层（L1）的神经元源性神经营养因子（Neuron-Derived Neurotrophic Factor, NDNF）阳性细胞。这两类细胞通过复杂的去抑制微环路，像音乐的指挥家一样，精细调控着皮层神经元的兴奋性，并在关键期可塑性中扮演着关键角色。有研究表明，在ACx关键期内光遗传学抑制5-HT₃R细胞，会消除经验依赖的拓扑图谱可塑性。同时，ELS已知会影响大脑5-羟色胺系统和5-HT₃R的表达。然而，关于Htr3a基因（编码5-HT₃A受体蛋白亚基）在ACx的NDNF⁺和VIP⁺细胞中如何随发育变化，以及ELS如何影响其表达，我们仍知之甚少。

为了解决这一知识空白，由James T. Moore、Merri J. Rosen等人组成的研究团队在《Neurobiology of Stress》上发表论文，深入探究了发育和ELS对听觉皮层内5-HT₃R表达中间神经元的影响。他们假设，在ACx关键期，Htr3a的表达具有细胞类型和皮层层级特异性，并且ELS会通过改变这些神经元的密度和Htr3a的表达水平，从而长期改变皮层功能和神经可塑性。

为了验证这一假设，研究人员主要运用了以下关键技术方法：研究以蒙古沙鼠为模型，设置了对照组（P10、P15、P30）和两种ELS模型（束缚应激ELS_R和旷场隔离应激ELS_O）组。他们采用RNAscope多重荧光原位杂交（FISH）技术，在脑片上同时检测NDNF、VIP和Htr3a的mRNA。通过高分辨率显微镜成像，对初级听觉皮层A1区域内L1-L4中的NDNF⁺和VIP⁺细胞进行定量分析，包括细胞密度、每个细胞内Htr3a mRNA斑点数量以及NDNF mRNA斑点数量。统计分析采用了广义线性混合模型（GLMM）和Mann-Whitney U检验等方法。

研究结果

NDNF和VIP细胞分布

研究确认了NDNF和VIP作为标记这两群细胞的分子是互斥的。在所有样本中，共识别出1164个NDNF⁺细胞，其中73.5%位于L1层；VIP⁺细胞更为丰富，共2110个，主要分布在L2/3（68.3%）和L4（28.8%）。

NDNF和VIP细胞群密度在ACx关键期内下降

在正常发育过程中，NDNF⁺和VIP⁺细胞的密度（细胞数/mm2）从P10到P30显著下降。例如，L1的NDNF⁺细胞密度在CTR10显著高于CTR15，L2/3的VIP⁺细胞密度在CTR10显著高于CTR15，并在CTR15到CTR30期间继续显著下降。

ELS减弱了NDNF和VIP细胞群密度的下降

与P30的对照组相比，ELS条件下两种细胞的密度均有所升高。例如，ELS_R组的L1 NDNF⁺细胞密度显著高于对照组。L2/3的VIP⁺细胞密度在ELS_R组也显著高于对照组。这表明ELS延缓了发育过程中这类细胞密度的自然下降。

5HT3a mRNA表达在正常发育过程中增加

对Htr3a mRNA的定量显示，其在VIP⁺细胞中的表达范围（0-328个斑点/细胞）远高于NDNF⁺细胞（0-137个斑点/细胞）。统计分析（GLMM）表明，在正常发育过程中，VIP⁺细胞在所有皮层（L1, L2/3, L4）中均表现出Htr3a mRNA的发育性上调。而NDNF⁺细胞的Htr3a表达水平相对稳定，变化较小。

ELS以层级特异性方式增加VIP⁺细胞中的5HT3a mRNA表达

ELS处理进一步影响了Htr3a的表达。在VIP⁺细胞中，ELS_O应激使L2/3细胞的Htr3a表达显著高于对照组，而ELS_R应激则使L4细胞的Htr3a表达显著升高。这表明不同的应激范式对Htr3a表达的影响具有层级特异性。相比之下，ELS对NDNF⁺细胞中Htr3a表达的影响较小且不一致。

NDNF mRNA表达在正常发育过程中下降

研究人员还量化了NDNF⁺细胞自身NDNF mRNA的表达。发现正常发育过程中，L1层NDNF⁺细胞的NDNF mRNA表达从P10到P30显著下降，表明其存在发育性下调。

NDNF mRNA表达大多不受ELS影响

ELS处理（无论是ELS_R还是ELS_O）对NDNF⁺细胞中NDNF mRNA的整体表达水平没有产生显著影响。

研究结论与意义

本研究系统地描绘了听觉皮层关键期内5-HT₃R表达中间神经元（NDNF⁺和VIP⁺细胞）的发育轨迹及其对ELS的响应模式。主要结论可归纳为以下几点：

1. 1.
   发育轨迹：在正常发育过程中，ACx浅层的NDNF⁺和VIP⁺细胞密度在耳廓开放（约P11）后的关键期（P10-P30）内显著下降，同时VIP⁺细胞中的Htr3a mRNA表达则显著上调。这种细胞数量的减少可能与活动依赖的细胞凋亡有关，而受体表达的增加则可能增强了这些细胞对5-HT的敏感性，以适应关键期环路重塑的需要。
2. 2.
   ELS的显著影响：ELS干预“冻结”了发育进程，表现为：（a）阻止了NDNF⁺和VIP⁺细胞密度在关键期内的正常下降，使其在P30时仍维持在高于对照组的水平；（b）进一步上调了VIP⁺细胞（尤其是在L2/3和L4层）的Htr3a mRNA表达，超出了正常生理水平。这种影响因应激方式（束缚vs旷场隔离）和皮层层级的不同而存在差异。
3. 3.
   潜在机制与功能启示：ELS导致的细胞密度维持和Htr3a表达上调，可能共同导致听觉皮层浅层局部环路的兴奋/抑制平衡被打破。VIP⁺细胞通常通过抑制其他抑制性神经元（如PV细胞）来去抑制锥体神经元，从而增强皮层输出。NDNF⁺细胞则整合自上而下和自下而上的信息，对皮层柱进行增益调节。它们的异常活动（可能由于对5-HT的反应性增强）可能会间接影响PV中间神经元的功能和存活（已知ELS会降低PV表达），而PV细胞对于精确的时序信息处理至关重要。这可能是ELS导致听觉时序处理缺陷的潜在环路机制。

综上所述，这项研究揭示了发育和ELS通过调节听觉皮层中5-HT₃R阳性中间神经元的数量和分子表观，从而影响皮层环路功能和可塑性的新机制。这些发现不仅增进了我们对早期环境因素如何“雕刻”大脑感觉皮层的理解，也为探索与ELS相关的神经精神疾病（特别是伴有感觉处理异常者）的病理生理机制和潜在干预靶点提供了重要线索。未来研究需要进一步明确这些分子和细胞水平的变化如何转化为神经元活动模式和听觉感知行为的改变。