《Poultry Science》：Optimization of Electroporation Conditions for Sperm Cells of Jiangxi Kangle Chicken (
Gallus gallus)
编辑推荐：
本研究针对传统禽类基因编辑效率低、操作复杂等问题，通过系统优化江西康乐鸡精子电穿孔条件（电压、脉冲数、脉冲时长），建立了高效、损伤小的精子转染方案。结果表明，在100 V、5 ms、5脉冲条件下，外源DNA摄取效率达57.1%，且精子关键受精能力参数（前向运动力、顶体完整性、线粒体膜电位）无显著变化，为精子转染辅助基因编辑（STAGE）技术在禽类育种中的应用提供了重要技术支撑。
在当今全球家禽产业中，基因编辑技术正发挥着越来越重要的作用，例如通过增强经济性状、培育抗病品系、开发载体疫苗、改善动物福利、提升禽蛋食用安全性以及在鸡蛋中生产药用蛋白等。然而，目前禽类基因编辑主要依赖传统的体外或体内原始生殖细胞（Primordial Germ Cell, PGC）途径，其编辑效率相对较低，且通常需要筛选两代以上才能获得纯合基因编辑个体，过程耗时费力。因此，开发一种更高效、更简捷的禽类基因编辑方法成为该领域亟待解决的问题。
在此背景下，精子转染辅助基因编辑（Sperm Transfection Assisted Gene Editing, STAGE）技术应运而生。该技术通过在受精前将外源基因编辑元件导入精子细胞，再利用人工授精或体外受精产生转基因个体，有望规避复杂的胚胎操作，缩短育种周期。电穿孔技术作为一种安全、经济且操作简单的物理转染方法，被广泛应用于将外源DNA、RNA或蛋白质导入细胞。但其应用于禽类精子，特别是江西康乐鸡（Gallus gallus）精子的最佳条件尚不明确。为了推动STAGE技术在禽类基因编辑中的应用，研究人员迫切需要优化鸡精子的电穿孔条件，在保证高转染效率的同时，最大限度地维持精子的受精潜能。
本研究旨在系统优化江西康乐鸡精子的电穿孔条件，并全面评估转染后精子的生理状态。研究论文发表在《Poultry Science》上。
为了达成研究目标，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，利用计算机辅助精子分析系统（Computer-Assisted Sperm Analysis, CASA）精确评估精子动力学参数；其次，采用低渗肿胀试验（Hypotonic Swelling Test, HOST）和FITC-PSA荧光染色分别检测精子细胞膜和顶体膜的完整性；再者，使用JC-1荧光探针通过流式细胞术分析精子线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential, ΔΨm）；最后，通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术定量分析Cy-3标记的外源DNA被精子摄取的效率。实验样本为从6只成年江西康乐公鸡采集并经质量筛选后的混合精液。
Effect of pulse voltage on sperm-related parameters
研究人员首先探讨了脉冲电压（0-300 V）对精子相关参数的影响。结果显示，随着电压升高，精子总活力、前向运动力、曲线运动速度（VCL）、平均路径速度（VAP）、直线运动速度（VSL）以及细胞膜完整性均显著下降（P < 0.05）。顶体完整性和线粒体膜电位也呈轻微下降趋势。值得注意的是，当电压设置为100 V时，精子对外源DNA的摄取效率最高，接近60%。而当电压达到300 V时，精子活力和功能出现明显受损。
Effect of the number of electrical pulses on sperm-related parameters
在确定最佳电压（100 V）后，研究人员进一步优化了电脉冲次数（0-10次）。结果表明，随着脉冲次数增加，精子总活力和细胞膜完整性显著降低（P < 0.05），而前向运动力、顶体完整性和线粒体膜电位仅有轻微下降。当脉冲次数为5次时，外源DNA摄取效率达到峰值（近60%）。脉冲次数增至10次时，VAP和VSL出现极显著下降（P < 0.01）。
Effect of electrical pulse duration on sperm-related parameters
最后，研究人员优化了电脉冲持续时间（0-50 ms）。研究发现，随着脉冲时长增加，精子总活力、前向运动力、细胞膜完整性和VCL显著降低（P < 0.05）。当脉冲时长为5 ms时，外源DNA摄取效率最高，接近60%。其他运动学参数则相对稳定。
Determination of the optimal electroporation conditions for chicken sperm
通过系统优化，研究最终确定了江西康乐鸡精子的最佳电穿孔条件：电压100 V，脉冲次数5次，脉冲时长5 ms。在此优化条件下，精子外源DNA摄取效率达到57.1%。与未电穿孔的阴性对照组相比，与受精能力密切相关的关键参数，包括精子前向运动力、顶体完整性和线粒体膜电位，均未发生显著变化；仅有精子总活力和细胞膜完整性出现显著但程度有限的下降（P < 0.05）。这表明优化后的电穿孔条件对精子功能造成的损伤最小，能够较好地维持其受精潜力。
在讨论部分，研究人员深入分析了电穿孔参数（电压、脉冲数、脉冲时长）与转染效率及细胞损伤之间的关系。他们指出，转染效率与这些参数在一定范围内呈正相关，但超过临界值（本研究确定为100 V, 5脉冲, 5 ms）后，DNA摄取效率和细胞存活率均会下降，这与其他物种（如牛、猪、斑马鱼）及不同类型细胞的研究结果一致。其内在机制可能与高电压导致不可逆电穿孔、脉冲持续时间过长引起电极杯发热、细胞膜脂质过氧化、膜蛋白损伤、细胞内钙离子（Ca2+）稳态失衡、ATP耗竭以及活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）大量产生等因素有关。研究人员还比较了本研究结果与其他物种精子电穿孔研究的异同，并分析了可能的原因，如电穿孔系统类型的差异。他们提出，未来采用毛细管电穿孔（Capillary Electroporation）这一新技术，通过减小电极间距和反应体积，有望进一步提高鸡精子的转染效率和存活率。最后，研究人员展望了将本研究优化的STAGE技术与高效ssDNA插入-CRISPR（Easi-CRISPR）基因编辑技术相结合的应用前景。这种组合策略有望在单代内获得双等位基因插入的基因编辑家禽，从而极大地节省时间和成本，加速家禽育种进程，对全球家禽产业具有重大意义。
综上所述，本研究成功优化了江西康乐鸡精子的电穿孔条件，在获得较高外源DNA转染效率（57.1%）的同时，最大限度地保护了精子的关键受精功能。这为后续应用精子转染辅助基因编辑（STAGE）技术进行高效禽类基因编辑奠定了坚实的技术基础，为克服传统PGC途径的局限性提供了新的解决方案，对推动家禽育种技术的发展具有重要意义。
