《Frontiers in Oncology》：MYO19 is associated with tumor progression, immune evasion, ferroptosis-related signatures in lung squamous cell carcinoma
1 引言
肺鳞癌(Lung Squamous Cell Carcinoma, LUSC)作为非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)的主要亚型，在全球肺癌病例中约占20-30%。尽管靶向治疗和免疫治疗取得了进展，但晚期LUSC患者的五年生存率仍低于20%，这主要归因于晚期诊断、肿瘤进展侵袭性强以及对当前治疗的耐药性。肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)中的复杂调控网络介导了LUSC与免疫系统之间的相互作用。近期研究揭示了LUSC的阶段依赖性免疫学特征：早期肿瘤表现出增强的细胞毒活性和新抗原负荷增加，而晚期则以免疫抑制性浸润为特征，特别是M0/M2巨噬细胞和浆细胞。此外，免疫细胞动力学（如树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和记忆CD4+T细胞的变化）与疾病进展和预后密切相关。吸烟作为主要风险因素，通过重编程肿瘤代谢、损害自然杀伤(Natural Killer, NK)细胞功能以及通过内皮功能障碍和肥大细胞休眠促进免疫抑制微环境，从而加剧免疫失调。
MicroRNAs (miRNAs)正在成为癌症生物学中的关键调控因子，影响肿瘤生长、免疫逃避和铁死亡(Ferroptosis)——一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡形式。例如，miR-665通过Wnt5a/β-连环蛋白(β-catenin)通路促进增殖，并通过靶向Caspase-3抑制凋亡，而LINC01607作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)，通过隔离miR-892b和增加P62表达来增强线粒体自噬(Mitophagy)和耐药性。值得注意的是，hsa-miR-520a-3p已被确定为急性髓系白血病和食管鳞状细胞癌中的肿瘤抑制因子，但其在LUSC中的作用尚未明确。
MYO19是一种线粒体肌动蛋白动力蛋白，与线粒体运输和癌症进展有关。其缺陷会增强活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)梯度，可能促进转移。ROS是癌症生物学中的关键介质，调节致癌信号、免疫反应和基因组不稳定性。铁死亡与ROS信号传导和线粒体代谢相交织，使其成为克服癌症治疗耐药性和免疫逃避的有前景的靶点。
本研究旨在探讨MYO19在LUSC中的作用，特别关注其受hsa-miR-520a-3p的调控及其对铁死亡的影响。研究结果揭示，MYO19过表达与LUSC中肿瘤进展和铁死亡抵抗的特征相关，并受hsa-miR-520a-3p负向调控。这一调控轴可能有助于免疫逃避和铁死亡抵抗，为LUSC的发病机制和潜在治疗策略提供了新的见解。然而，需要进一步的机制研究来建立因果关系。
2 方法
2.1 数据收集
从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)、UCSC XENA、ENCORI、人类蛋白质图谱(Human Protein Atlas, HPA)和UALCAN公共数据库检索包含mRNA、miRNA及相关临床信息的数据。
2.2 差异表达分析
从UCSC数据库下载统一标准化的癌症数据集（TCGA TARGET GTEx, PANCAN, N = 19131, G = 60499），并提取跨样本的MYO19基因表达数据。选择来源如正常实体组织和原发性实体肿瘤的样本，对每个表达值应用log2(x + 0.001)转换，并排除样本数少于三个的癌症类型。使用CPTAC数据从UALCAN门户获取MYO19蛋白表达数据，并使用TCGA RNA测序数据评估MYO19的诊断价值。
2.3 预后分析
从TCGA数据库下载LUSC STAR-counts数据及相应的临床信息，提取TPM格式数据，并使用log2(TPM + 1)进行标准化。保留同时具有RNAseq数据和临床信息的样本用于后续分析。进行单变量和多变量Cox比例风险回归分析，用森林图可视化结果，并构建诺莫图(Nomogram)预测5年总生存期。使用R软件（v4.0.3）进行统计分析，当P < 0.05时认为结果显著。此外，使用Kaplan-Meier Plotter研究不同肿瘤类型中MYO19表达与总生存期(Overall Survival, OS)的相关性。
2.4 MYO19与免疫的相关性
使用TIMER分析多癌组织中MYO19表达水平与免疫细胞浸润或免疫检查点表达的相关性。使用TISIDB分析MYO19与趋化因子、趋化因子受体和主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex, MHC)分子的关系，并使用SangerBox网站探讨各种癌症中MYO19表达与基质评分(StromalScore)、免疫评分(ImmuneScore)、估计评分(ESTIMATEScore)和肿瘤浸润免疫细胞(Tumor Infiltrating Immune Cells, TIICs)的相关性。应用Spearman等级相关分析评估变量之间的关系。所有相关分析均使用R（版本4.2.2）中的cor.test函数进行，采用双尾检验，显著性阈值p < 0.05。
2.5 MYO19与相关miRNA的相关性
研究了LUSC中MYO19相关的miRNA调控网络。使用starbase和miRDB等工具预测潜在的上游miRNA，仅选择有交集的miRNA作为候选。基于ceRNA假说，使用ENCORI平台评估候选miRNA与MYO19表达的相关性，该平台使用TCGA项目表达数据和miRNA-seq数据。本研究中，使用公开可用的LUSC TCGA数据集分析miR-520a-3p的表达。未在患者样本中进行实验验证，研究结果不应被视为临床诊断声明。
2.6 与铁死亡相关基因的相关性
铁死亡相关基因来源于Ze-Xian Liu对癌症中铁死亡的系统分析。使用Wilcoxon检验评估样本组间的显著性，当P < 0.05时认为结果显著。
2.7 细胞培养和抗体
HEK293、NCI-H226和NCI-2170细胞购自中国科学院细胞库（中国上海），并在实验前常规检测支原体为阴性。HEK293细胞维持在杜尔贝科改良 Eagle 培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM)中。NCI-H226和NCI-2170细胞维持在RPMI-1640培养基中。所有培养基均补充有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS; Gibco)和1%青霉素-链霉素（100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素）。细胞在37°C、5% CO2的加湿培养箱中培养。以下一抗用于免疫印迹：MYO19 (ab116792; Abcam)、ACSL4 (PAB34846, Bioswamp)、SLC7A11 (A2413, Abclonal) 和 GAPDH (MAB374; Millipore)。
2.8 谷胱甘肽测定和MDA测定
使用总谷胱甘肽测定试剂盒(S0052; Beyotime)和MDA测定试剂盒(S0131M; Beyotime)按照制造商的方案定量细胞内谷胱甘肽(Glutathione, GSH)和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)。简言之，NCI-H226细胞首先用阴性对照或miR-520a-3p转染12小时，然后用Flag-EV或Flag-MYO19质粒再转染24小时。随后用20 μM RSL3 (SML2234; Sigma-Aldrich)处理细胞24小时。然后收集并裂解细胞，按照试剂盒说明测量GSH和MDA水平，并在适用情况下归一化至总蛋白含量。报告至少三个独立实验的结果。
2.9 CCK-8测定
为测量细胞活力，将每孔2,000个NCI-H226细胞接种到96孔板中，并按指示转染阴性对照或miR-520a-3p抑制剂/模拟物。接种后第1、2、3和4天，向每孔加入10 μL CCK-8试剂(C0042; Beyotime)，在37°C避光孵育1小时。使用无细胞孔作为空白，在酶标仪(Bio-Rad, USA)上读取450 nm处的吸光度。实验进行三次重复。
2.10 Transwell迁移实验
对于Transwell迁移，将用阴性对照或miR-520a-3p抑制剂转染的5,000个NCI-H226细胞重悬于无血清培养基中，并接种到24孔Transwell小室(ECM508; Millipore Sigma)的上室中。下室含有补充了10% FBS作为化学引诱物的培养基。在37°C培养48小时后，轻轻去除上表面未迁移的细胞。下膜上的迁移细胞用试剂盒的细胞染色剂染色20分钟，使用Leica DM5000显微镜成像，并通过计数每个小室的五个随机视野进行量化。
2.11 实时定量聚合酶链反应
使用Trizol试剂(Invitrogen)按照生产商的说明提取总RNA。对于miR-520a-3p检测，使用miRNA第一链cDNA合成试剂盒(Vazyme, MR101, China)合成cDNA。对于MYO19检测，使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(K1622, Thermo Fisher Scientific)将总RNA反向转录为互补DNA(complementary DNA, cDNA)，然后使用TB Green? Premix Ex Taq? (RR420A, TaKaRa)进行定量PCR。mRNA水平与GAPDH比较，miRNA水平与U6比较。本研究中用于qPCR分析的引物由Tsingke Biotechnology Co., Ltd. (中国)合成，序列如下：
miR-520a-3p: F, 5′-ACACTCCAGCTGGGAAAGTGCTTCCC-3′, R, 5′-CTCAACTGGTGTCGT GGA-3′。 U6: F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′, R, 5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。 MYO19:F, 5′-AGCCCATATCCTGCCAAAG-3′, R, 5′-CAGCCGAGTCACCAGTTATG-3′。 GADPH: F 5′-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3′, R 5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。
本研究中使用的hsa-mir-520a-3p的miRNA抑制剂和模拟物由吉玛基因(上海，中国)生成，并使用Lipofectamine 2000 (11668019, Thermo Fisher Scientific)按照制造商方案转染到NCI-H226或NCI-H2170细胞中。靶向hsa-mir-520a-3p的序列如下：hsa-mir-520a-3p抑制剂 (B03001, GenePharma, China): 5′-ACAGUCCAAAGGGAAGCACUUU-3′。 hsa-mir-520a-3p模拟物 (B02001, GenePharma, China): F, 5′-AAAGUGCUUCCCUUUGGACUGU-3′, R, 5′-AGUCCAAAGGGAAGCACUUUUU-3′。
2.12 荧光素酶报告基因检测
从公共数据库获得MYO19的上游候选miRNA及其预测的结合位点。将野生型和突变型MYO19 3'UTR报告质粒与指定的miRNA模拟物共转染到HEK293细胞中，使用LipoMax (LipoMax32012; Sudgen)按照制造商方案进行。转染后48小时，使用双荧光素酶(Dual-Glo?)检测系统(E2920; Promega)测量荧光素酶活性；每个孔的萤火虫信号均归一化至海肾荧光素酶信号。数据代表至少三个独立实验。
2.13 统计分析
本研究中的统计分析使用前述在线数据库进行。实验数据以三次独立生物学实验的平均值±标准差表示。使用R (v4.0.3)进行统计分析，两组比较使用Wilcoxon检验，三组或以上样本比较使用Kruskal-Wallis检验。P值< 0.05被认为具有统计学显著性。
3 结果
3.1 MYO19的跨癌谱分析和LUSC特异性过表达
基于TCGA数据的跨癌比较分析显示，MYO19在多种癌症类型中显著上调。对33种癌症类型的转录谱分析表明，与匹配的正常组织相比，68.2%的恶性肿瘤中MYO19显著升高，其中LUSC显示出最显著的差异表达。这些发现确立了MYO19作为一个多癌致癌特征，尤其是在肺鳞癌中。
LUSC特异性验证通过多组学整合证实了这种模式。图表显示，在TCGA和GTEx数据集中，LUSC肿瘤组织中MYO19 mRNA表达均上调，具有一致且稳健的统计学显著性（p < 0.0001）。一致地，来自CPTAC数据库的数据证明，LUSC组织中的MYO19 mRNA水平显著高于正常肺组织。总体而言，数据表明MYO19在LUSC中明显过表达，表明其在肿瘤生物学中的潜在作用。
3.2 MYO19在LUSC中的预后意义
接下来，我们研究了MYO19是否是LUSC的独立预后因素。单变量Cox回归分析结果显示，MYO19表达升高与较差的总生存期显著相关（风险比[Hazard Ratio, HR] = 1.298，95%置信区间[Confidence Interval, CI]: 1.070–1.353，p = 0.00075）。其他临床变量，包括pT分期、pN分期和pM分期，也显示出与患者结局的显著关联。诺莫图分析通过整合MYO19表达和关键临床特征来预测1年、3年和5年生存概率，进一步证实了这些发现。此外，在不同分期（N0、N1和N2）的单变量Cox分析显示，MYO19表达与N0分期的不良预后相关（HR = 1.4, p = 0.00141）。这些提示了MYO19在LUSC中潜在的预后意义。
MYO19表达与患者预后的联系通过Kaplan-Meier生存分析得到加强。MYO19高表达患者的总生存期显著低于低表达患者（对数秩检验[log-rank test] p = 0.011, HR = 1.32, 95% CI: 1.10–1.56）。这些结果强烈表明MYO19是LUSC不良预后的可靠标志物。除了其预后价值外，MYO19表达与临床和行为因素密切相关。例如，如图所示，曾经吸烟者和当前吸烟者的MYO19表达显著高于非吸烟者。这一发现指出了吸烟与LUSC中MYO19上调之间的潜在联系。
此外，我们检查了不同癌症分期中MYO19 mRNA和蛋白的表达水平。图表显示，随着癌症分期的进展，MYO19 mRNA表达逐渐增加，表明其在肿瘤进展和侵袭性中的潜在作用。在蛋白水平上，LUSC肿瘤组织中的MYO19表达显著高于正常组织（p < 0.001）。免疫组织化学分析证实了这一观察结果，显示LUSC组织中有强烈的MYO19染色，而正常组织中染色微弱或缺失。总的来说，这些发现突出了MYO19在LUSC中的表达升高，并表明其在驱动疾病进展和不良临床结局中的潜在作用。
3.3 LUSC中MYO19表达与免疫相关基因的相关性
为了研究不同癌症类型中MYO19表达与免疫相关基因家族的不同相关性，我们分析了MYO19表达与各种癌症中趋化因子、趋化因子受体和MHC基因的相关性矩阵。如图所示，MYO19在大多数癌症类型中与免疫相关基因呈广泛正相关，但其在LUSC中的表达与这些基因主要呈负相关。LUSC中的这种独特模式表明，MYO19可能破坏免疫相关通路或免疫基因表达，导致该癌症类型中独特的肿瘤免疫微环境。
对MYO19与免疫检查点基因关系的进一步分析提供了更多见解。比较了MYO19高表达、低表达患者和正常受试者中免疫检查点基因的表达水平。与MYO19低表达组相比，MYO19高表达组中CD274（程序性死亡配体1, PD-L1）和IGSF8显著上调，而大多数其他免疫检查点基因，包括细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein 4, CTLA4)、HAVCR2 (TIM-3)、LAG3、PDCD1（程序性细胞死亡蛋白1, PD-1）和TIGIT，在MYO19高表达组中显著下调。值得注意的是，这些免疫检查点基因的表达水平在LUSC组和正常组之间存在显著差异。这种反向表达模式表明，MYO19可能选择性地与免疫检查点通路相关，可能减弱某些免疫检查点的表达，同时上调其他检查点，如PD-L1。
LUSC中MYO19与免疫检查点基因之间这种复杂的关系在图中得到进一步探讨。与整体模式一致，CD274 (PD-L1)与MYO19表达呈正相关，而大多数其他免疫检查点基因，包括CTLA4、LAG3和PDCD1，则显示负相关。这些发现表明，MYO19表达与PD-L1相关的免疫检查点通路和较高的肿瘤免疫功能障碍和排斥(Tumor Immune Dysfunction and Exclusion, TIDE)评分相关，这与免疫逃避表型相容。
此外，如图所示，LUSC中MYO19表达与升高的TIDE评分相关。TIDE评分用于评估肿瘤免疫功能障碍和排斥，在MYO19高表达组中显著高于MYO19低表达组和正常组（Kruskal-Wallis检验，p < 0.001）。较高的TIDE评分表明免疫逃逸潜力增强，对免疫检查点抑制剂（例如，PD-1/PD-L1和CTLA-4抑制剂）反应的可能性降低。这意味着高MYO19表达的肿瘤更具免疫抑制性，可能逃避免疫监视，进一步限制免疫治疗的疗效。
3.4 MYO19表达与LUSC中肿瘤微环境特征和增殖特征相关
为了进一步探索MYO19在LUSC肿瘤微环境中的作用，我们评估了其与微环境评分的相关性。如图所示，MYO19表达与基质评分(StromalScore)呈负相关（r = -0.43, p = 1.2e-23），表明MYO19高表达肿瘤中基质含量较低。类似地，与免疫评分(ImmuneScore)的强负相关（r = -0.46, p = 5.2e-27）表明免疫细胞浸润减少，而结合免疫和基质细胞丰度的估计评分(ESTIMATEScore)也显示出显著的负相关（r = -0.47, p = 1.0e-28）。总的来说，这些发现表明，高MYO19表达的肿瘤以浸润不良和免疫抑制的微环境为特征。
除了对免疫和基质评分的影响外，MYO19表达与LUSC中的炎症活性呈负相关。如图所示，MYO19表达与炎症反应特征呈负相关（r = -0.479, p < 0.0001），表明肿瘤微环境内炎症过程受到抑制。此外，MYO19与肿瘤炎症特征负相关（r = -0.363, p = 2.72e-17），并与白细胞介素10(Interleukin-10, IL-10)抗炎信号通路负相关（r = -3.39e-01; p =8.19e-15），表明MYO19高表达肿瘤激活免疫刺激炎症过程的能力降低。这些结果暗示，高MYO19表达可能通过抑制免疫激活的炎症反应来促进免疫逃避。
与免疫和炎症特征的负相关相反，MYO19表达与肿瘤增殖呈强正相关。如图所示，MYO19表达与肿瘤增殖特征正相关（r = 0.452, p < 0.0001），表明MYO19可能促进肿瘤生长和细胞增殖。
3.5 LUSC中hsa-miR-520a-MYO19轴的鉴定和功能验证
为了探索LUSC进展中MYO19表达的调控机制，我们使用starBase和miRDB数据库进行了全面分析。在预测靶向MYO19的20个miRNA中，hsa-miR-520a-3p被确定为最强候选者，与MYO19表达显示出显著相关性。生物信息学分析证实了hsa-miR-520a-3p在MYO19的3'-非翻译区(3'-Untranslated Region, 3'-UTR)的直接结合位点，支持其调控作用。表达分析显示，与癌旁正常组织相比，hsa-miR-520a-3p在LUSC
