磷酸盐溶解菌在四环素-铅复合污染下的多机制协同修复：磷酸盐沉淀与有机酸络合作用研究

《Frontiers in Microbiology》：Multi-mechanism synergistic remediation of phosphate-solubilizing bacteria under tetracycline and lead co-contamination stress: phosphate precipitation and organic acid complexation

本文综述了磷酸盐溶解菌（PSB）菌株CZ-M3（Microbacterium sp.）在四环素（TC）和铅（Pb2+）复合污染胁迫下的高效修复潜力。研究揭示了其通过代谢重编程（如抑制三羧酸循环（TCA）导致酒石酸积累）和胞外聚合物（EPS）分泌增加，形成以磷酸铅沉淀为主导，有机酸络合和EPS吸附为补充的协同修复网络。该工作为重金属-抗生素复合污染环境的生物修复提供了新的微生物资源和理论依据。

　　

1 引言

随着全球城市化和农业的发展，抗生素和重金属等持久性有毒污染物对环境和人类健康造成不可逆的危害。其中，四环素（TC）和铅（Pb）的复合污染因其协同毒性效应而成为一个特别具有挑战性的问题。据统计，全球每年抗生素消耗量约为1~2×10⁵吨。TC作为一种广谱抗生素，广泛应用于医疗、畜牧养殖和农业，其稳定的化学结构使其能够在环境中持久残留。超过70%的TC通过人畜粪便释放到环境中，造成严重污染。同时，Pb是另一种普遍存在的持久性有毒污染物，具有高毒性、生物累积性和持久性。关键的是，这些污染物经常共存于农业环境中，它们的相互作用可能导致更复杂的污染情景。例如，抗生素可以通过其官能团与重金属形成稳定复合物，改变金属的生物有效性和环境行为。这种相互作用迫切需要开发能够同时处理两种污染物的创新修复策略。

生物修复凭借其高效、环境友好和可持续性，已成为环境污染修复的核心技术之一。特别是微生物修复技术已被证明能有效修复抗生素和重金属污染。微生物通过多种机制对抗复合污染，包括细胞表面吸附、细胞内积累、酶转化和生物絮凝。这些机制不仅从环境中去除或降低污染物毒性，还能减轻污染物对微生物的细胞毒性，从而缓解细胞损伤。然而，目前关于TC-Pb复合污染下微生物耐受性和修复机制的研究仍然不足，高效、广谱功能微生物菌剂的开发仍面临挑战。

磷酸盐溶解微生物（PSM）是一类能够通过代谢活动将不溶性磷转化为可溶性磷的功能微生物群。其核心功能是分泌有机酸、质子（H⁺）和磷酸酶等活性物质，溶解无机磷或矿化有机磷，从而释放出植物或微生物可利用的磷酸根离子（PO₄^3?）。除了其农学重要性，PSM在环境修复方面显示出巨大潜力。PSM通过释放有机酸增加酸度和PO₄^3?来促进TC水解。同时，PSM利用自身分泌的胞外蛋白吸附重金属离子，并通过有机酸和生物酶产生PO₄^3?，与重金属离子形成矿物沉淀。然而，PSM在TC-Pb复合污染胁迫下的修复机制，特别是代谢适应（如有机酸分泌谱的变化）以及磷酸盐沉淀与有机酸络合之间的协同效应，仍处于探索阶段。一个关键未解决的问题是PSM的代谢网络在复合胁迫下如何改变以驱动协同修复。

本研究旨在筛选对TC和Pb复合污染具有高效修复潜力的磷酸盐溶解细菌，并阐明其在复合污染条件下的TC降解机制和Pb固定化机制。本研究将为开发针对TC-Pb复合污染的生物修复技术提供理论基础，有助于优化环境修复策略和提高修复效率。

2 材料与方法

2.1 磷酸盐溶解菌的分离与鉴定

从农药厂污染的土壤样品中分离磷酸盐溶解菌。将1克土壤样品加入含有LB液体培养基的锥形瓶中，在36°C、180 rpm振荡培养72小时。将1毫升菌悬液用无菌盐水系列稀释，然后采用涂布法接种于LB固体培养基上，在36°C有氧培养48小时。挑选形态不同的单一菌落，通过划线法纯化，获得两株细菌：CZ-M3和CZ-B5。通过16S rRNA基因测序对纯化菌株进行鉴定。

2.2 具有最佳溶磷能力和胁迫耐受性的PSB筛选

（1）溶磷功能验证

本研究采用液体溶磷法验证CZ-M3和CZ-B5的溶磷功能。将2毫升菌悬液分别加入100毫升PVK液体培养基和NBRIP液体培养基中，在30°C、180 rpm振荡培养72小时。在不同时间点（1, 3, 6, 12, 24, 48, 72小时）取培养液离心过滤，使用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定上清液中可溶性磷含量。PVK培养基包含葡萄糖10克，(NH₄)₂SO₄0.5克，NaCl 0.3克，KCl 0.3克，FeSO₄·7H₂O 0.3克，MgSO₄·7H₂O 0.3克，MnSO₄·4H₂O 0.03克，酵母提取物0.5克，Ca₃(PO₄)₂5克，用去离子水定容至1升。NBRIP培养基包含葡萄糖10克，Ca₃(PO₄)₂5克，MgCl₂·6H₂O 5克，MgSO₄·7H₂O 0.25克，KCl 0.2克，(NH₄)₂SO₄0.1克，用去离子水定容至1升。

（2）TC和Pb²⁺胁迫实验

将2毫升菌悬液加入100毫升含有不同浓度TC（50, 100, 200 mg/L）或Pb²⁺（500, 1000, 2000, 3000 mg/L，来源于Pb(NO₃)₂）的LB培养基中。在35°C、180 rpm振荡培养72小时。在不同时间点（1, 3, 6, 12, 24, 48, 72小时）测量吸光度（OD₆₀₀）以表征细菌生长。培养后，取不同胁迫浓度下的样品（72小时）离心过滤。分别通过高效液相色谱法（HPLC）和ICP-OES测定溶液中的TC浓度和Pb²⁺浓度。每个处理设置三个重复。

2.3 磷酸盐溶解菌生长特性研究

本研究基于最佳溶磷能力和最高胁迫耐受性筛选用于TC-Pb协同修复的菌株。将2毫升选定的最优菌株的菌悬液加入100毫升LB培养基中。在不同温度（30, 35, 40°C, pH=7）和不同初始pH（4, 5, 6, 7, 8, 温度=35°C）下，于180 rpm振荡培养72小时。测量不同时间点（1, 3, 6, 12, 24, 48, 72小时）的吸光度（OD₆₀₀）以表征细菌生长。每个处理设置三个重复。

2.4 磷酸盐溶解菌对TC-Pb复合污染修复机制研究

基于菌株筛选和生长特性结果，本研究建立了三个TC-Pb复合污染处理进行修复实验。TC和Pb的浓度比分别为200 mg/L:500 mg/L, 50 mg/L:500 mg/L, 和50 mg/L:1000 mg/L。将2毫升菌悬液加入100毫升含有混合TC和Pb²⁺胁迫的LB溶液中，在35°C、180 rpm振荡培养72小时。在不同时间点（1, 3, 6, 12, 24, 48, 72小时）测量细菌生长（OD₆₀₀）。每个处理设置三个重复，以无胁迫处理作为对照。所有测定浓度（mg/L）均扣除培养基背景值进行校正。此外，将不同处理72小时后的样品离心进行固液分离。

一部分液体样品用于三维激发-发射矩阵（3D-EEM）分析，另一部分通过0.22 μm滤膜过滤，用于后续通过HPLC测定有机酸和TC浓度，以及通过ICP-OES测定Pb²⁺含量。一部分固体样品干燥后用于衰减全反射红外光谱（ATR-IR）、X射线衍射（XRD）和电化学测量。另一部分用于扫描电子显微镜（SEM）分析。固体样品用2.5%戊二醛固定24小时，然后用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤三次，每次15分钟。随后，用乙醇梯度（20, 50, 75, 80, 90, 99%，各10分钟）脱水，然后进行冷冻干燥以备测量。

2.5 仪器与测试方法

2.5.1 菌株鉴定方法

使用FastDNA SPIN Kit提取基因组DNA。使用引物27F和1492R对16S rRNA基因进行PCR扩增。通过BLAST程序比对核苷酸序列，然后使用MEGA7.0软件构建系统发育树。

2.5.2 样品检测与分析

液体样品的检测项目包括细菌OD₆₀₀、可溶性总磷、Pb²⁺、TC、有机酸（甲酸、草酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸）以及溶液中的生物分泌物。相关检测方法参考先前研究。使用紫外-可见分光光度计测定菌液OD₆₀₀值。使用ICP-OES测定可溶性总磷和Pb²⁺浓度，样品在测定前离心并通过0.22 μm滤膜过滤，使用国家标准溶液制备标准曲线。使用HPLC测定TC和有机酸浓度，色谱柱为Inertsustain AQ-C18柱（5 μm, 4.6 × 250 mm），进样量20 μL，流速1 mL/min，流动相为0.25% KH₂PO₄缓冲溶液和甲醇（体积比99:1, 2.5%, pH=2.8），柱温30°C，检测波长210 nm。使用三维激发-发射矩阵光谱（3D-EEM）检测生物分泌物，激发和发射波长范围为250至800 nm，衍射狭缝宽度为5 nm。

固体样品的检测包括XRD、ATR-IR、SEM和电化学检测。相关检测方法参考先前研究。使用XRD测定矿物组成，通过JADE 6.0软件与PDF卡片比对确认矿物类型。使用ATR-IR分析固体样品中的官能团特征。使用SEM和能量色散X射线光谱（EDS）检测固体样品的形态和元素组成。使用电化学工作站对干燥样品进行循环伏安法（CV）测试，以碳电极为工作电极和对电极，饱和甘汞电极为参比电极。

3 结果与讨论

3.1 菌株的分离与鉴定

通过划线法分离纯化获得CZ-M3和CZ-B5。CZ-M3生长相对缓慢，在培养36小时后达到旺盛生长状态，菌落呈黄色，无可溶性色素。相比之下，CZ-B5生长迅速，在12小时内形成灰白色或浅黄色、粗糙、不透明、色泽均匀的菌落。16S rRNA基因扩增获得CZ-M3约1403 bp片段和CZ-B5约1430 bp片段。序列分析显示，菌株CZ-M3与Microbacterium sp. F1同源性最高（99.86%），系统发育分析将其置于同一分支。因此，CZ-M3被鉴定为微杆菌属（Microbacterium sp.）。菌株CZ-B5与芽孢杆菌属（Bacillus sp.）同源性最高（99.86%），在系统发育树中是其最近缘种，故鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。两株菌已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏号分别为GCMCC 1.60034（CZ-M3）和GCMCC 1.60035（CZ-B5）。

3.2 菌株的溶磷作用与抗逆性

3.2.1 溶磷效果

在NBRIP培养基体系中，CZ-M3和CZ-B5均表现出随时间的推移而增加的溶磷动力学，且两株菌的溶磷趋势相似。在培养初期（0–24小时），CZ-M3和CZ-B5的溶磷速率显著增加，随后进入缓慢释放阶段。至72小时培养结束时，两株菌的溶磷量差异为5.98 mg/L。值得注意的是，当培养基体系转换为PVK时，观察到两株菌的溶磷效率存在显著差异。与CZ-B5相比，CZ-M3表现出更强的活化磷能力。培养72小时后，CZ-M3的溶磷能力比CZ-B5高69.1%，其溶磷动力学曲线始终保持较高的斜率值。这一现象表明CZ-M3具有更强的溶解不溶性磷源的能力。

3.2.2 抗逆性

（1）TC胁迫实验

菌株在不同浓度TC胁迫下的生长结果表明，当TC浓度≤200 mg/L时，CZ-M3和CZ-B5均保持良好的存活状态，且CZ-M3的TC去除效果优于CZ-B5。200 mg/L浓度的TC对CZ-M3和CZ-B5的生长均有抑制作用。CZ-M3的生长在6小时开始进入对数生长期，48小时后进入稳定期。CZ-B5的生长趋势与CZ-M3相似，但其OD值在整个过程中均低于CZ-M3，这证实了CZ-M3比CZ-B5具有更强的TC抗性。培养72小时后，CZ-M3对TC（50, 100, 和200 mg/L）的去除率分别比CZ-B5高2.57%、4.99%和3.21%。

（2）Pb²⁺胁迫实验

当Pb²⁺浓度≤1000 mg/L时，两株菌均表现出良好的耐受性，其OD₆₀₀值在前48小时内逐渐增加。当Pb²⁺浓度达到2000 mg/L时，CZ-M3和CZ-B5的OD₆₀₀值显著下降，且在培养后期未出现恢复性增殖，表明2000 mg/L的Pb²⁺浓度超过了CZ-B5和CZ-M3的临界阈值。值得注意的是，在Pb²⁺浓度≤1000 mg/L的条件下，CZ-M3的OD₆₀₀值显著优于CZ-B5，表明CZ-M3比CZ-B5具有更强的Pb²⁺胁迫抗性。此外，CZ-M3对500 mg/L和1000 mg/L Pb²⁺胁迫的去除率（72小时）比CZ-B5高5.8–6.0%。这种现象可能归因于Pb毒性增加，严重抑制了细菌的繁殖和生长功能，从而干扰了其对Pb的吸附。

综上所述，CZ-M3在PVK培养基中表现出比CZ-B5高69.1%的溶磷能力，并且在胁迫条件下生长更好，对TC和Pb²⁺的去除效率更高。因此，选择CZ-M3作为修复TC-Pb复合污染的核心功能菌株，进一步研究其生长性能。

3.3 CZ-M3的生长特性

CZ-M3在pH 7.0时OD₆₀₀值最高，表明该pH环境最适合CZ-M3生长。当体系pH升高至弱碱性（pH 8.0）时，CZ-M3的生长仅受到轻微抑制（与中性环境相比下降约4.4%），表明CZ-M3也可以在弱碱性条件下生存。在更强的碱性条件下，CZ-M3发生显著的代谢紊乱，导致生长抑制。在酸性条件（pH≤6）下，CZ-M3完全丧失增殖能力，表明其不适合在酸性环境中生存。

CZ-M3在不同温度下的生长曲线表明，该菌株在30°C时表现出最佳代谢活性，其OD₆₀₀值显著高于其他温度，表明这是该菌株的最适生长温度。此外，CZ-M3在30–40°C温度范围内保持良好的存活状态。在35–40°C时，CZ-M3的生长在24小时后趋于稳定，而在30°C时，CZ-M3的生长在48小时后开始下降。CZ-M3在30–40°C之间保持高活性的能力表明其对温度具有良好的适应性。

3.4 复合污染下CZ-M3的修复效果

在三种TC-Pb复合污染处理中，CZ-M3在50 mg/L TC + 500 mg/L Pb²⁺组中表现出最高的生长活性，在200 mg/L TC + 500 mg/L Pb²⁺组中活性最低。在低胁迫组（50 mg/L TC + 500 mg/L Pb²⁺）中，TC和Pb²⁺的去除率分别比相应单一胁迫条件下低1.30%和4.00%。这表明复合污染对CZ-M3产生更强的抑制作用，可能损害其修复功能。

当Pb²⁺浓度增加（50 mg/L TC + 1000 mg/L Pb²⁺）时，TC和Pb²⁺的去除率分别为41.98%和52.0%，表明高浓度的Pb²⁺显著抑制了菌株对TC的去除。相比之下，当TC浓度较高（200 mg/L TC + 500 mg/L Pb²⁺）时，去除率分别为TC 43.3%和Pb²⁺74.0%。值得注意的是，TC的增加似乎刺激了Pb²⁺的去除，而Pb²⁺的增加则降低了对两种污染物的去除。这很可能是因为较高的Pb²⁺浓度接近CZ-M3的耐受极限，从而损害了其生存能力和修复能力。

3.5 复合污染下CZ-M3的形态特征

扫描电子显微镜观察显示，在无胁迫条件下，CZ-M3细胞呈杆状，长度为0.6–1.0 μm，表面光滑。培养72小时后，CZ-M3细胞周围存在胞外分泌物。在200 mg/L TC + 500 mg/L Pb²⁺培养条件下，CZ-M3的细胞被明显的晶体包裹，细胞发生变形，表明TC-Pb复合污染阻碍了CZ-M3的生长和发育。在50 mg/L TC + 500 mg/L Pb²⁺组中，CZ-M3的细胞同样被明显的晶体包裹，细胞本身发生变形。在50 mg/L TC + 1000 mg/L Pb²⁺组中，CZ-M3细胞周围的晶体显著增加，细胞尺寸比前两组（200 mg/L TC + 500 mg/L Pb²⁺和50 mg/L TC + 500 mg/L Pb²⁺）减小了0.3–0.5 μm。

在不同TC和Pb浓度下，EDS分析揭示了磷酸盐溶解菌CZ-M3及其代谢产物对Pb修复机制的差异。在无胁迫的CK组中，细菌分泌物中的主要成分是C（79.71%）和O（17.17%），P含量为0.68%。在50 mg/L TC + 500 mg/L Pb²⁺组中，P（1.03%）和Pb（6.50%）的含量较CK组增加，表明TC和Pb的胁迫激活了CZ-M3的适应性反应。在200 mg/L TC + 500 mg/L Pb²⁺组中，包裹细胞的晶体中P（1.46%）和Pb（10.44%）的含量增加。在50 mg/L TC + 1000 mg/L Pb²⁺组中，Pb含量显著增加至24.7%，P（2.17%）和Cl（0.5%）的含量也增加。CZ-M3通过溶解磷酸盐产生PO₄^3?，然后与Pb²⁺结合形成矿物。TC和Pb浓度的增加引发了CZ-M3的应激反应，从而增强了分泌物的释放。

3.6 复合污染下微生物分泌物特征

3.6.1 3D-EEM分析

在TC-Pb复合污染胁迫下，通过3D-EEM光谱分析的峰位移动和强度变化可以解读CZ-M3的代谢响应机制。在CK组中，主要检测到两个特征峰：峰1（Ex/Em=455/435 nm，强度443.11）和峰2（Ex/Em=390/370 nm，强度324.43），它们对应于腐殖质。在复合污染下，峰1的荧光强度显著增加，峰位略有移动（Ex/Em=435–455/425–440 nm，强度9800.81–9939.6）。这种变化可能源于CZ-M3的自我保护机制，导致腐殖酸类物质的结构重构或含量增加。腐殖酸类物质含有大量羧基和酚羟基等官能团，可以通过静电吸引、络合和离子交换等机制固定Pb²⁺或TC。新出现的峰3（Ex/Em=520–525/500–505 nm，强度8552.13–8564.86）很可能是微生物在胁迫下产生的分泌物。此外，峰2完全消失，这可能是由于TC-Pb复合污染胁迫干扰了细菌的正常代谢途径。

3.6.2 有机酸分泌特性

有机酸的分泌对于磷酸盐溶解菌的溶磷和重金属修复至关重要。在不同浓度的TC和Pb²⁺胁迫下，CZ-M3分泌的有机酸存在显著差异。在无胁迫组中，检测到较高浓度的酒石酸（13670.14 mg/L）、柠檬酸（2862.73 mg/L）和苹果酸（3035.13 mg/L）。在混合胁迫下，酒石酸含量显著增加，而柠檬酸含量显著减少，这可能归因于高浓度TC可能抑制了三羧酸循环（TCA）中关键酶的活性，从而阻断了柠檬酸的合成途径，反而促进了酒石酸的积累。此外，在高浓度TC（200 mg/L）胁迫下，琥珀酸含量的减少与CK组相比最为显著，这可能是由于TC诱导阻断了琥珀酸前体——中间产物柠檬酸的合成。

研究表明，酒石酸可以通过羧基和羟基官能团与Pb²⁺形成稳定络合物，并诱导磷酸盐释放生成不溶性磷酸铅沉淀。在高浓度Pb²⁺