《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Immunogenicity of subunit vaccine of E2 protein against atypical porcine pestivirus in pigs
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本研究成功构建原核表达系统制备猪非典型瘟病毒（APPV）E2亚单位疫苗，评估三种佐剂（ISA 201VG、IMS 1313VG、Gel 02）的免疫效果。结果表明，ISA 201VG与Gel 02佐剂组能诱导更高水平特异性抗体（ELISA检测），且ISA 201VG组攻毒后器官病毒载量（qRT-PCR检测CT值>36）显著低于对照组，病理切片显示疫苗组器官结构完整。研究为APPV疫苗开发提供关键实验依据。
引言：猪非典型瘟病毒（APPV）是引起新生仔猪先天性震颤（CT）A-II型的主要病原体，对全球养猪业造成重大经济损失。该病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），其基因组为约11 kB的单股正链RNA，编码的囊膜糖蛋白E2（长度241个氨基酸）是关键的免疫保护性抗原。研究表明，基于E2蛋白的亚单位疫苗在经典猪瘟病毒（CSFV）防控中已展现良好效果，这为开发APPV疫苗提供了理论依据。本研究旨在利用大肠杆菌（Escherichia coli）原核表达系统制备APPV E2亚单位疫苗，并系统评估不同佐剂对其免疫原性和保护效力的影响。
材料与方法：通过PCR扩增APPV E2基因（引物F: AGCTGCATCAAACGTCAGGATTA，R: GTGACGGTACATGGTCGCCG），构建重组质粒pET28a-APPV E2，转化至E. coli BL21感受态细胞。采用镍柱亲和层析纯化E2蛋白，Western blot验证其表达（分子量约28 kDa）。将纯化蛋白分别与三种佐剂（ISA 201VG按1:1重量比、IMS 1313VG按1:1体积比、Gel 02按95:5体积比）乳化，制备疫苗（蛋白浓度100 μg/mL）。选取3–4周龄APPV阴性仔猪，随机分为四组（每组5头）：A组（PBS对照组）、B组（ISA 201VG佐剂疫苗）、C组（IMS 1313VG佐剂疫苗）、D组（Gel 02佐剂疫苗），于0和21天进行两次免疫。定期采集血清，通过间接ELISA检测E2特异性抗体水平（判定阈值S/N≥2.5）。免疫后35天，对A、B组进行攻毒试验（肌肉注射APPV阳性血液，病毒CT值=19.17），监测临床症状及体温，14天后剖检采集器官组织，通过qRT-PCR检测病毒载量（NS3基因靶点，CT值<36为阳性），并制作H&E染色病理切片观察组织病变。
结果：系统进化分析显示，本研究使用的APPV毒株（CH/GD/2019/12）与中国多省份流行株亲缘关系接近。Western blot证实E2蛋白成功表达。ELISA结果显示，佐剂疫苗组抗体水平均显著高于对照组（p<0.05），其中ISA 201VG组（S/N均值49.00）和Gel 02组（44.61）诱导的抗体滴度明显高于IMS 1313VG组（16.38）。攻毒后各组仔猪均未出现典型临床症状或体温异常。qRT-PCR检测显示，对照组所有器官病毒载量均呈阳性（CT值21.80–28.62），以淋巴结（腹股沟淋巴结CT=21.80，下颌淋巴结CT=22.53）和小脑（CT=23.31）病毒含量最高；而ISA 201VG疫苗组各器官均未检测到病毒（CT值36.87–38.11）。病理学观察进一步证实，对照组淋巴结结构破坏（淋巴滤泡消失、结缔组织增生）、脾脏白髓减少、肝脏空泡变性、肾脏肾小管上皮细胞萎缩、小脑白质空泡化及浦肯野细胞结构紊乱；疫苗组各器官形态正常。
讨论：本研究首次利用大肠杆菌表达系统制备APPV E2亚单位疫苗，证实其可诱导仔猪产生高水平特异性抗体，其中ISA 201VG和Gel 02佐剂效果显著优于IMS 1313VG。攻毒保护试验表明，疫苗能有效清除器官中的APPV，尤其对淋巴组织和小脑具有显著保护作用。淋巴结和小脑的高病毒载量提示APPV可能通过侵袭免疫系统和神经系统导致病理损伤，这与既往报道中APPV免疫抑制作用和先天性震颤症状相符。研究局限性在于未深入探讨细胞免疫应答机制，且佐剂优选策略需结合大规模田间试验验证。
结论：APPV E2蛋白具有良好的免疫原性和攻毒保护效果，ISA 201VG与Gel 02可作为疫苗佐剂的优先选择。该研究为APPV亚单位疫苗的后续开发提供了关键实验数据和技术支撑。
