《Frontiers in Immunology》：Dysregulated Tfh/B cells and their interactions in neuromyelitis optica spectrum disorder
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本文聚焦于水通道蛋白4抗体（AQP4-ab）阳性的视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD），通过对比急性发作期、缓解期患者及健康对照者，系统揭示了循环滤泡辅助性T细胞（Tfh）与B细胞亚群的比例失调及其相互作用机制。研究发现急性期Tfh（尤其ICOS+亚群及活化Tfh17）、浆母细胞等显著升高，且血清白细胞介素6（IL-6）、IL-21、CXCL13水平异常增高，并与残疾评分（EDSS）正相关；体外实验证实Tfh与B细胞存在双向促进作用，且IL-6/IL-21信号通路及抗CD20、抗γ干扰素（IFN-γ）等干预可调控该过程，为NMOSD的免疫治疗提供了新靶点。
引言
视神经脊髓炎谱系疾病（Neuromyelitis Optica Spectrum Disorder, NMOSD）是一种主要累及视神经和脊髓的炎症性自身免疫性疾病，其最特异的生物标志物为抗水通道蛋白4抗体（Anti-Aquaporin-4 Antibody, AQP4-ab）。急性发作时患者残疾程度评分（Expanded Disability Status Scale, EDSS）显著升高，常需大剂量甲泼尼龙、血浆置换或静脉注射免疫球蛋白等治疗，缓解期则多采用免疫抑制剂或生物制剂维持。已有研究提示，辅助性T细胞17（Th17）相关细胞因子如白细胞介素6（IL-6）、IL-17、IL-21等参与NMOSD炎症病灶形成，滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells, Tfh）、B细胞亚群及趋化因子CXCL13的异常也备受关注。复发期患者循环Tfh细胞、转换记忆B细胞、浆母细胞比例及血清CXCL13水平显著高于缓解期及健康对照，而初始B细胞和过渡型调节性B细胞比例降低。T、B细胞间的相互作用在NMOSD发生发展中至关重要：体外实验表明Tfh细胞通过分泌IL-21促进B细胞增殖、分化及抗体产生，而B细胞亦可反向调节Tfh细胞分化。然而，AQP4-ab阳性NMOSD患者中Tfh与B细胞亚群间的相互作用机制尚未完全阐明。
材料与方法
本研究纳入复旦大学附属华山医院神经内科收治的AQP4-ab阳性NMOSD患者，以及年龄、性别匹配的健康对照者。所有患者均经固定细胞间接免疫荧光法检测血清AQP4-ab，并符合2015年国际NMOSD诊断标准。记录人口学与临床特征，包括急性发作（定义为新发或加重的神经功能缺损持续超过24小时）与缓解期（接受至少6个月维持治疗）患者。排除血清AQP4-ab阴性及曾接受生物制剂治疗者。研究获华山医院伦理委员会批准，所有参与者签署知情同意书。
采用流式细胞术分析外周血Tfh与B细胞亚群比例。全血样本经荧光标记单克隆抗体染色、红细胞裂解后，用Attune声聚焦流式细胞仪检测。同时分离外周血单个核细胞，通过FACSMelody分选仪分选CD4+CXCR5+Tfh细胞、CD19+B细胞、CD19+CD27–初始B细胞及CD19+CD27+记忆B细胞。将纯化细胞进行单独培养或共培养6天，并加入不同干预因素（如IL-6、IL-6R–Fc、IL-21R–Fc、抗CD20、抗IFN-γ、抗IL-10单克隆抗体等）。培养结束后收集细胞及上清，以流式细胞术检测表型变化，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-6、IL-21、CXCL13及AQP4-ab水平。数据分析采用SPSS、GraphPad Prism及R软件，组间比较使用方差分析或非参数检验，相关性分析采用Spearman法。
结果
人群特征
共纳入63名受试者，包括21例急性发作期NMOSD患者、21例缓解期患者及21名健康对照。三组年龄、性别比例无显著差异。急性发作期患者EDSS评分显著高于缓解期。3例急性期患者样本采集前曾接受一剂静脉免疫球蛋白治疗；缓解期患者口服泼尼松中位剂量为5毫克/天。
Tfh与B细胞亚群在急性发作期比例失调
急性发作期患者循环CD4+CXCR5+Tfh细胞频率显著高于缓解期及健康对照。其中ICOS+Tfh细胞比例在急性期更高；ICOS+Tfh中，CXCR3?CCR6+（活化Tfh17）亚群显著升高，而CXCR3+CCR6?（活化Tfh1）和CXCR3?CCR6?（活化Tfh2）亚群比例降低；（活化Tfh2+活化Tfh17）/活化Tfh1比值在急性期显著升高。
B细胞方面，急性期CD19+B细胞中CD27+IgD?（转换记忆B细胞）、CD27?IgD?（双阴性B细胞）、CD27hiCD38hi（浆母细胞）亚群及CD19+CD138+短寿浆细胞比例显著高于健康对照，而CD27?IgD+（初始B细胞）和CD24hiCD38hi（过渡型调节性B细胞）比例降低。
急性发作期血清IL-6、IL-21、CXCL13水平升高及相关性分析
急性期血清IL-6、IL-21、CXCL13水平均显著高于缓解期及健康对照。相关性分析显示，EDSS评分与循环CD4+CXCR5+Tfh细胞比例、血清IL-6、IL-21、CXCL13水平呈正相关；Tfh细胞比例与血清IL-6、IL-21水平正相关；CD19+B细胞比例与血清IL-6水平亦呈正相关。
Tfh细胞促进B细胞增殖、分化及AQP4-ab产生
共培养实验中，Tfh细胞显著促进B细胞增殖、浆母细胞分化及AQP4-ab分泌。急性期患者来源的Tfh细胞（pTfh）对浆母细胞分化和AQP4-ab产生的促进作用强于健康对照来源Tfh（cTfh），而缓解期患者来源Tfh（pTfh′）作用较弱。加入IL-21R–Fc可抑制B细胞各亚群分化及AQP4-ab产生。
IL-6促进Tfh与B细胞分化及功能
随着IL-6浓度升高，Tfh细胞中转录因子BCL6表达比例及培养上清IL-21水平显著增加，而其他T细胞表型无显著变化。在B细胞中，IL-6浓度升高选择性增加CD27hiCD38hi浆母细胞比例并促进AQP4-ab分泌，对其他B细胞亚群无显著影响。
IL-6R–Fc与IL-21R–Fc对Tfh与B细胞的不同作用
IL-6R–Fc显著抑制Tfh细胞CD4+比例、增殖、ICOS、PD-1、BCL6表达及IL-21分泌，但增加CXCR5比例；IL-21R–Fc仅降低BCL6表达。在B细胞中，IL-6R–Fc显著抑制浆母细胞比例及AQP4-ab水平；IL-21R–Fc则显著抑制CD27+IgD?、浆母细胞比例及AQP4-ab产生，且对AQP4-ab的抑制弱于IL-6R–Fc。
B细胞亚群对Tfh细胞的反馈调节作用
CD19+B细胞可增强Tfh细胞增殖、ICOS及BCL6表达。患者来源B细胞（pB）对BCL6表达及IL-21分泌的促进作用强于健康对照B细胞（cB），该效应可被抗CD20单抗逆转。记忆B细胞（CD19+CD27+）能提升Tfh细胞CD4+比例、增殖、CXCR5、ICOS、BCL6表达，且患者来源记忆B细胞（pBmem）作用更强，该效应被抗IFN-γ单抗抑制。初始B细胞（CD19+CD27?）促进Tfh增殖但降低CD4+比例；健康对照初始B细胞（cBnaive）对BCL6及IL-21的抑制作用可被抗IL-10单抗逆转。
讨论
本研究证实AQP4-ab阳性NMOSD急性发作期循环Tfh与B细胞亚群失调，伴随IL-6、IL-21、CXCL13水平升高，且这些指标与EDSS评分正相关。Tfh与B细胞存在双向促进作用：Tfh细胞驱动B细胞增殖、分化及AQP4-ab产生；B细胞及其亚群（尤其是记忆B细胞）增强Tfh细胞增殖、分化及IL-21分泌，该过程可被抗CD20、抗IFN-γ单抗抑制，而被抗IL-10单抗增强。
Tfh细胞表面标志包括CXCR5、ICOS、PD-1、CD40L，关键转录因子为BCL6，主要分泌IL-21。本研究显示急性期活化Tfh17升高，提示其具有强致病性及辅助B细胞应答的能力。缓解期Tfh活性低于健康对照，可能与长期免疫抑制治疗有关。B细胞亚群中，转换记忆B细胞、双阴性B细胞、浆母细胞在急性期升高，而初始B细胞与过渡型调节性B细胞减少，后者可能经免疫治疗部分逆转。浆母细胞及浆细胞是AQP4-ab主要来源，IL-6可促进其抗体分泌。CXCL13作为CXCR5配体，由活化T细胞等产生，参与自身免疫病中异位生发中心形成及B细胞向中枢神经系统迁移。
体外实验进一步明确Tfh对B细胞的促进作用以IL-21依赖为主，且急性期Tfh功能最强，缓解期最弱。IL-6通过诱导BCL6推动Tfh早期分化及IL-21分泌，并直接促进浆母细胞分化和AQP4-ab产生。IL-6R–Fc对Tfh表型及IL-21的抑制强于IL-21R–Fc，而IL-21R–Fc对B细胞分化和AQP4-ab产生的抑制更显著，提示IL-6/IL-21信号轴在Tfh–B细胞互作中各有侧重。托珠单抗（抗IL-6R单抗）在NMOSD临床治疗中可降低复发率、调节Tfh/B细胞平衡，支持IL-6R为重要治疗靶点。
B细胞对Tfh的反馈调节中，记忆B细胞通过IFN-γ促进Tfh分化，初始B细胞则通过IL-10起抑制作用，抗CD20单抗可阻断B细胞对Tfh的增强效应。本研究构建了“IL-6–Tfh–B细胞轴”在NMOSD发病中的关键作用模型。
局限性包括样本量较小、分选CD4+T细胞而非初始T细胞可能引入其他IL-21来源、部分急性期患者曾接受免疫调节治疗、功能实验样本量有限等。
结论
在AQP4-ab阳性NMOSD中，循环Tfh与B细胞亚群失调，伴随IL-6、IL-21、CXCL13水平升高。Tfh与B细胞存在双向促进的相互作用网络，共同参与疾病免疫病理过程。
