《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Olanzapine affects bone formation via oral Enterococcus through SAA1 gene and extracellular matrix-related pathways
背景
随着社会压力的增加，精神分裂症等精神疾病的发病率显著上升。作为全球十大致残原因之一，精神分裂症给社会带来了沉重的经济负担。非典型抗精神病药物是目前治疗精神分裂症最常用的方法，奥氮平是其中应用最广泛的药物之一。它是一种多巴胺-血清素拮抗剂，与5-羟色胺2A受体（5-HT2A）具有高亲和力，能有效缓解患者的精神病症状。然而，奥氮平的使用会进一步加剧精神分裂症患者的骨代谢异常，高达三分之二的患者在服药后出现骨矿物质密度受损。因此，奥氮平对骨代谢的影响不容忽视。
非典型抗精神病药物可通过多种途径恶化骨代谢。主流观点认为，抗精神病药物主要通过上调催乳素水平引起骨代谢异常。然而，一些研究发现精神分裂症患者服用奥氮平后，血清催乳素水平并不总是出现显著变化，这表明奥氮平可能通过非高催乳素血症途径诱导骨代谢异常。
微生物群已被证明与骨形成密切相关。人体中超过一半的细菌定植于胃肠道（29%）和口腔（26%）。肠道和口腔微生物群均被证明可影响骨代谢，且肠道微生物群的变化也可能影响口腔微生物群。此外，有报道称非典型抗精神病药物具有一定的抗菌特性，可引起肠道微生物群紊乱，但关注口腔微生物群的研究较少。奥氮平给药后口腔微生物群的变化及其对骨代谢的影响需要进一步研究。
因此，本研究旨在探讨奥氮平加剧精神分裂症患者骨代谢异常和引起微生物群失衡的临床现象，有助于探索口腔微生物群失调的作用和机制，为解决患者用药后骨代谢异常提供新的治疗靶点和研究方向。
结果
奥氮平治疗导致骨量显著下降
临床研究中，服用奥氮平的男性患者腰椎（–0.36 vs. 0.91）、股骨颈（–0.49 vs. 1.34）和髋部（–0.09 vs. 1.06）的Z值显著低于对照组。女性患者的腰椎（–0.51 vs. 0.32）和股骨颈（–0.63 vs. 0.27）Z值也较低，髋部有降低趋势。在总样本中，未经调整的线性回归显示，奥氮平使用与所有骨骼部位的较低骨密度（BMD）Z值相关。经过多变量调整后，关联仍然具有统计学意义且略有增强。这些发现表明服用奥氮平的患者存在骨量丢失。
随后通过体内动物实验和体外细胞实验验证这一假设。结果显示，经奥氮平灌胃处理12周后，实验组小鼠体重低于对照组。进一步的微型计算机断层扫描（micro-CT）结果显示，奥氮平组小鼠第一和第二磨牙之间的骨量减少，同时骨体积分数（BV/TV）和小梁骨数量（TbN）显著降低，小梁骨分离度（TbSp）显著增加。
奥氮平治疗后小鼠口腔微生物群组成发生改变
奥氮平干预后，提取小鼠口腔唾液进行16S核糖体RNA（rRNA）测序。稀释曲线最终趋于水平，表明测序深度足够，样本测序量合理。α多样性分析评估了小鼠口腔微生物群的丰富度、均匀度和多样性。结果显示，奥氮平干预后，代表微生物群落丰富度的Observed Species指数、Chao1指数和ACE指数无统计学差异。与小鼠口腔微生物群落多样性密切相关的Simpson指数、Shannon指数和PD whole tree指数也无统计学差异。
基于β多样性，3D主坐标分析（PCoA）显示对照组和奥氮平处理组的口腔微生物组成存在明显分离。置换多因素方差分析（PERMANOVA）证实组间存在显著差异。
奥氮平可能通过影响肠球菌丰度影响小鼠骨量
比较经奥氮平处理和未处理小鼠口腔微生物群落的组成差异，发现在属水平上，奥氮平处理小鼠中的肠球菌（Enterococcus）、Muribacter和Bergeyella显著增加，同时葡萄球菌（Staphylococcus）显著减少。在显著增加的细菌中，肠球菌与骨代谢密切相关。在未用奥氮平处理的小鼠唾液中几乎检测不到肠球菌，而奥氮平处理小鼠口腔中肠球菌的相对表达量在0.0001至0.0018之间。随机森林模型也将肠球菌确定为顶级预测菌属。在一项基于人类唾液的小型辅助试验中，奥氮平组的唾液肠球菌相对载量高于对照组。
随后提取了肠球菌的脂磷壁酸（LTA）。用0、10和20 μg/mL LTA处理人牙周膜干细胞（hPDLSCs）7天后，碱性磷酸酶（ALP）染色显示，LTA处理的hPDLSCs染色强度呈浓度依赖性显著降低。这些结果表明肠球菌LTA对hPDLSCs的成骨分化具有抑制作用，且在一定范围内浓度越高抑制作用越强。
之前的实验发现奥氮平干预导致人和小鼠骨量下降，同时奥氮平干预后小鼠唾液中出现原本不存在的肠球菌，服用奥氮平个体唾液中的肠球菌丰度也增加。因此怀疑肠球菌可能是奥氮平诱导骨量变化的潜在原因，但相关机制有待后续验证。
奥氮平治疗后小鼠骨组织细胞外基质出现改变
研究从炎症和胶原形成两个方面探讨了奥氮平引起骨丢失的合理机制假设。关于炎症，观察到奥氮平处理小鼠骨组织中存在免疫细胞浸润，表明存在局部炎症活动。
接下来研究胶原形成。COL1A2抗体的免疫组织化学染色结果显示，奥氮平组磨牙区牙周膜中的棕色染色较对照组浅，牙周膜干细胞（PDLSCs）和成骨细胞（OB）中棕色最深。骨保护素（OPG）抗体的免疫组化染色显示对照组和奥氮平组颜色无显著差异。天狼星红染色后，光学显微镜下可见奥氮平组和非奥氮平组牙周膜中密集的红色束状纤维。在偏振光下，对照组小鼠牙周膜中可见大量亮黄色的I型胶原纤维，排列密集有序。相比之下，奥氮平处理小鼠牙周膜中的黄色I型胶原显著减少，颜色变暗，排列更加紊乱。
值得注意的是，免疫组化染色中牙周膜干细胞和成骨细胞的染色变化最为明显。考虑到口腔的代表性，选择牙周膜干细胞作为体外研究的实验细胞。
肠球菌LTA通过上调SAA1基因诱导细胞外基质变化
为了进一步研究机制，使用人牙周膜干细胞进行体外实验。用肠球菌LTA干扰hPDLSCs 7天，提取RNA进行转录组测序。平均碱基错误率小于0.04%，表明测序质量评估良好。观察到同组内差异较小，但不同组间差异显著。与对照组相比，LTA组hPDLSCs中有153个基因上调，178个基因下调。前20个差异表达基因包括SAA1、NKD1、USP53、DKK1、IRS2、SHISA9、TMEM97、B3GALT2、HMGCS1和ANKRD1基因表达增加，而CXCL12、CLDN11、SLC14A1、LOC102724560、COL15A1、FRAS1、PLPP3、PENK、PLAU和TGFBI基因表达减少。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，差异表达基因与细胞外基质相关通路和功能密切相关。
在前20个差异表达基因中，选择了与骨代谢密切相关的SAA1、CXCL12、NKD1、CLDN11、DKK1、COL15A1、FRAS1、TGFBI和PLAU基因。基于同源性测试排除了CLDN11基因，其余基因通过定量聚合酶链反应（qPCR）进一步验证。此外，上述大多数基因相关通路也与细胞外基质或KEGG排名较高的通路（如核因子κB（NF-κB）信号通路）相关。qPCR结果显示，SAA1表达上调最显著，而COL15A1表达下调最显著。SAA1是全转录组测序中差异表达最显著的基因。因此，选择SAA1进行后续实验。
肠球菌LTA可能通过促进SAA1表达抑制COL1A1表达，最终抑制成骨分化
为了进一步探索SAA1基因在肠球菌LTA抑制成骨分化中的作用，在hPDLSCs中抑制SAA1基因，随后进行ALP染色和qPCR分析。在ALP染色中，抑制hPDLSCs中的SAA1基因增强了染色强度并增加了染色面积。qPCR结果表明，抑制SAA1基因后，hPDLSCs中COL1A1基因的表达上调。抑制SAA1基因导致COL1A1基因表达上调，提示两者之间可能存在相互作用。使用PDBePISA网站和PyMol工具分析SAA1和COL1A1之间的关系，揭示两种蛋白很可能结合并有多个相互作用位点。SAA1（结构2）和COL1A1（结构1）之间的界面面积为2689 ?2，该对接模式下的自由能（ΔG）为-27.7 kcal/mol。因此，肠球菌可能通过在基因表达和蛋白质作用水平上促进SAA1表达来抑制COL1A1，从而抑制hPDLSCs的成骨。
讨论
通过临床试验和动物实验，本研究发现长期使用奥氮平可引起骨量减少，并伴随肠球菌丰度增加。结合细胞实验，本研究提示这些肠球菌的变化与SAA1基因相关。基于此，可以提出一个合理的假设：奥氮平可能增加肠球菌的丰度，其成分（LTA）可能通过SAA1介导的炎症和细胞外基质相关信号通路抑制成骨分化，提示肠球菌可能参与奥氮平诱导的骨丢失。未来需要更多的体内研究来验证这一点。
奥氮平常用于治疗精神分裂症，但服用奥氮平的精神分裂症患者会出现骨矿物质密度下降，这是非典型抗精神病药物的常见不良反应之一。研究发现奥氮平处理的小鼠骨量和体重也低于对照组。与此一致的是，其他研究也发现奥氮平干预3-4周后，小鼠股骨小梁骨丢失，小梁骨体积和连接性低于对照组。体重变化的机制复杂，与性别、品种和环境等因素有关。
然而，奥氮平引起骨代谢异常的机制尚不清楚。16S rRNA测序结果显示奥氮平可引起口腔微生物群变化，但微生物群的多样性和丰富度无显著差异。其他研究也发现奥氮平治疗后，精神分裂症个体微生物群的α多样性没有显著变化，但也有研究发现大鼠模型中微生物群落多样性下降，这可能与动物品系和饲养方式有关。
研究发现奥氮平干预后肠球菌丰度增加。在人类样本中也发现服用奥氮平的患者唾液中肠球菌更多。肠球菌是革兰氏阳性菌，属于哺乳动物的胃肠道菌群。先前研究表明奥氮平对肠道中的肠球菌有直接抗菌作用。在口腔中，肠球菌已被确定为常见的根管充填病原体。肠道菌群可能通过粪-口途径传播并影响口腔菌群。此外，与肠道菌群密切相关的疾病（如炎症性肠病和结肠炎）也可能影响口腔菌群，表明肠道菌群可能通过多种方式影响口腔菌群。奥氮平在减少肠道肠球菌后，可能进一步引起口腔肠球菌的代偿性增加。LTA是肠球菌的主要毒力因子之一。文献表明肠球菌在健康个体口腔中罕见，是机会性病原体。在口腔中检测到时，其丰度通常极低，但仍可表现出显著的致病性和环境耐受性。这与本研究一致。在对照组小鼠唾液中未检测到肠球菌，而奥氮平组中肠球菌可检测到但丰度仍较低。然而，即使在如此低的丰度水平，肠球菌仍可引起显著的组织损伤。研究证实肠球菌LTA可抑制成骨分化。其他研究也发现肠球菌体外干扰成骨细胞可抑制成骨分化。体内研究也表明肠球菌与骨量减少有关。例如，肠球菌感染已被证明可引起小鼠根尖周炎症并导致显著的骨破坏。在口腔外，研究发现肠球菌可引起小鼠炎症性肠病，而这种炎症与全身性骨丢失密切相关。在本研究中，奥氮平的使用与口腔肠球菌丰度的增加同时发生。结合上述证据，提出了一个假设：肠球菌可能是导致骨丢失的潜在因素之一，但其影响方式仍需进一步探索。
研究发现肠球菌LTA引起hPDLSCs炎症通路（NF-κB信号通路）的变化。与此一致的是，文献表明肠球菌可破坏上皮屏障，促进肠道炎症，也可能与根管感染和根尖周炎症的不同阶段有关。研究还发现全转录组测序中SAA1基因的上调最为显著。血清淀粉样蛋白A1基因（SAA1）编码血清淀粉样A载脂蛋白家族的一个成员。这是一种主要的急性期蛋白，在响应炎症和组织损伤时高表达。先前研究表明微生物群落可改变SAA1表达水平。粪便微生物群移植后，小鼠Saa1表达增加。在用低蛋白微生物群（LPM）和高脂微生物群（HFM）处理的小鼠中，后者Saa1基因表达增加。此外，孟德尔随机化（MR）分析发现增加Roseburia的丰度会降低SAA1水平。
此外，细胞外基质是指细胞周围复杂的大分子网络。胶原是细胞外基质的主要成分，其中I型胶原由两条α1链和一条α2链组成。细胞外基质不仅起支持和连接作用，还包含大量信号分子，与成骨密切相关。先前研究表明，受微小RNA（microRNA）影响的细胞外基质细胞因子变化可进一步影响胶原I α2的表达并引起成骨变化。本次研究发现通过骨组织染色发现细胞外基质中I型胶原减少。结合转录组测序结果，假设细胞外基质相关通路可能是肠球菌LTA抑制成骨分化的主要通路之一。先前研究也表明肠球菌可显著下调I型胶原（COL1）的表达水平，激活组织基质金属蛋白酶9（MMP9），并降解胶原和糖胺聚糖（细胞外基质的主要成分）。
进一步抑制SAA1基因发现COL1A1表达上调，成骨分化增强。其他研究检测羊膜成纤维细胞中COL1A1表达水平未显示显著差异，这与本研究结果差异的原因可能与细胞类型和处理方法有关。还预测SAA1和COL1A1编码的蛋白可能通过氢键和盐桥结合。ΔiG小于零表明对接结果有意义。具体而言，SAA1中的氨基酸17–108可能与COL1A1中的氨基酸88–1384相互作用。分子对接实验表明，SAA1中的Glu92、Asp78和Gln98等残基以及COL1A1中的Gly183、Gln1380和Glu1384可能是重要的结合位点。同时，SAA1已被证明可增加胶原酶MMP-1、MMP-8和MMP-13的丰度，同时减少交联胶原的酶——赖氨酰氧化酶样1的丰度。此外，其他研究提示SAA1可能通过自噬和MMP通路降解I型胶原。因此，SAA1可能通过影响COL1A1基因表达、直接作用于COL1A1编码的蛋白或通过自噬或酶相关通路间接影响I型胶原，从而通过细胞外基质相关通路抑制成骨分化。
本研究存在一些局限性。首先，体内模型未完全排除奥氮平诱导的其他潜在混杂因素，如催乳素水平改变或代谢通路变化，这些也可能影响骨代谢。其次，相对较小的样本量可能限制研究结果的普适性和统计效力。因此，肠球菌和SAA1的作用应被解释为探索性信号而非既定机制。未来研究应增加样本量，采用标准化动物模型，并在可行的情况下使用定植或清除模型直接评估肠球菌对骨表型的影响。
总之，我们提出了一个合理的假设：奥氮平可能增加口腔肠球菌的相对丰度，促进SAA1基因表达，从而抑制COL1A1基因表达。它还可能影响SAA1中氨基酸17–108与COL1A1中氨基酸88–1384之间的蛋白质相互作用，最终抑制骨形成。这些发现提示口腔微生物群改变与奥氮平诱导的骨代谢异常之间存在可能的联系，支持进一步研究基于微生物群的策略以减少骨骼并发症和维护口腔健康。
材料与方法
实验设计
本研究旨在探讨奥氮平加剧精神分裂症患者骨代谢异常和引起菌群失衡的机制。通过临床试验验证奥氮平对骨代谢的影响。建立奥氮平给药小鼠模型，研究骨组织和口腔菌群的变化。通过细胞实验和蛋白质相互作用预测，进一步探讨相关细菌对成骨的影响及机制。
临床试验
本研究共招募71名参与者。奥氮平组包括26名患者（17男9女），健康对照组包括45名个体（24男21女），两组间进行年龄匹配。纳入标准：奥氮平组患者符合《精神障碍诊断与统计手册》第四版（DSM-IV）精神分裂症诊断标准，且诊断由两名或以上主治或高级职称精神科医生独立确认。合格患者年龄在20至35岁之间（含），接受奥氮平单药治疗，剂量范围5至25毫克/天，并已连续规律奥氮平治疗超过6个月。健康对照组由20至40岁无精神疾病史的成年人组成。排除标准：如果参与者服用影响骨代谢的药物（如双膦酸盐、糖皮质激素、甲状旁腺激素、降钙素或活性维生素D类似物）超过6个月，则被排除。其他排除标准包括可能影响骨代谢的疾病，如未控制的糖尿病（糖化血红蛋白HbA1c > 7%）、甲状腺功能亢进或减退、原发性甲状旁腺疾病、骨关节炎、未解决的骨骼疾病，或过去6个月内有放疗或化疗史。双能X线吸收测定法（DXA）禁忌症的受试者也被排除。
本研究方案经中南大学湘雅二医院人类研究与伦理委员会批准。临床研究在美国国立卫生研究院ClinicalTrials.gov平台注册。所有程序严格遵守《赫尔辛基宣言》的伦理准则。所有实验均按照相关指南和规定进行。在向所有参与者详细解释研究程序后获得书面知情同意。所有与本研究相关的程序均在获得每位参与者书面知情同意后严格执行。
使用双能X线骨密度仪（DEXA）扫描仪测量腰椎、股骨颈和髋骨的骨矿物质密度（BMD）。鉴于生理骨密度存在显著的性别和年龄依赖性变异，计算Z值以最小化相关影响。Z值定义如下：Z值=（测量的BMD - 同年龄、性别、种族匹配参考人群的平均BMD）/参考人群BMD的标准差。
进行了一项辅助性唾液试验。排除标准：3个月内使用抗生素；采样当天使用抗菌漱口水；3个月内进行牙科/牙周手术；活动性口腔感染或急性呼吸道疾病；当前吸烟；主要全身性疾病或免疫抑制。在禁食、禁饮、禁口腔卫生≥30分钟后，通过被动流涎收集未刺激全唾液，立即分装并保存于-80°C。
奥氮平动物建模
选择3月龄雄性C57BL/6J小鼠。小鼠隔离适应1周，然后使用计算机生成的随机化方案随机分配到不同治疗组。给药前体重<18或>26克或身体状况不佳的小鼠被排除在实验外。所有小鼠在无特定病原体条件下饲养，动物设施控制温度、湿度和12小时光暗周期。小鼠自由获取无菌标准饲料和无菌水。将小鼠分为奥氮平组和对照组，每组10只。奥氮平组：3月龄小鼠用奥氮平（4毫克/千克/天）灌胃处理12周。使用相同处理方案给予溶剂的小鼠作为健康对照。分组和结果评估以盲法进行以减少偏倚。每周记录体重变化。根据每只小鼠调整奥氮平剂量。所有动物每日监测痛苦迹象，研究期间未触发预定义的人道终点。
动物研究经湘雅二医院实验动物伦理委员会审查批准。所有实验均按照相关命名指南和规定进行。作者遵守ARRIVE指南。
16S rRNA鉴定
样本提取：将无菌棉球放入小鼠口中，让其充分咀嚼，取出完全湿润的棉球放入EP管中。-80°C保存，液氮运输，送上海欧易生物科技有限公司进行16S rRNA测序。
DNA提取：使用MagPure Soil DNA LQ Kit按照试剂供应商说明从每个样本中分离DNA。使用NanoDrop 2000分光光度计和琼脂糖凝胶电泳评估DNA产量、纯度和完整性。
PCR扩增和文库构建：使用通用引物343F和798R对16S rRNA基因V3-V4高变区进行PCR扩增。两条引物均连接Illumina测序接头。使用凝胶电泳可视化扩增产物质量。使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化PCR产物，并用Qubit dsDNA检测试剂盒定量。然后调整浓度用于测序。
高通量测序、生物信息学：测序使用Illumina NovaSeq6000高通量测序平台，遵循其标准程序。原始数据为FASTQ格式，数据下机后，使用cutadapt软件预处理配对末端读长以检测和断开接头。修剪后，使用DADA2和QIME2默认参数过滤低质量序列、去噪、合并，并检测和切除嵌合读长以获得代表性序列和ASV丰度表。使用QIIME 2包选择每个ASV的代表性序列，并将所有代表性序列与数据库比对。16S使用Silva数据库比对。使用q2特征分类器默认参数在属和种水平进行物种比对注释和微生物组成与功能统计分析。通过比较相对丰度鉴定细菌基因的差异表达。使用Wilcoxon秩和检验评估微生物群落相对丰度的差异。使用α指数（ACE、Chao1、Shannon和Simpson）评估样本间细菌丰度和多样性。使用t检验比较α多样性指数。使用主坐标分析（PCoA）绘制样本群落组成的相似性或差异。此外，使用β多样性指数进行相似性分析（Adonis）以评估两组间群落结构差异的显著性
