《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：BMP4 dose dictates lineage specification bias in human periodontal ligament stem cells
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本文揭示了BMP4（骨形态发生蛋白4）剂量依赖性调控人牙周膜干细胞（PDLSCs）向成骨和成肌腱谱系分化的新机制。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和体外功能验证，研究发现低剂量BMP4（10 ng/mL）通过同时上调RUNX2和SCX维持细胞多能性，而高剂量BMP4（100 ng/mL）则优先促进成肌腱分化（SCX表达上调）并抑制成骨分化（RUNX2表达下调）。研究进一步揭示了成骨分化依赖BMPR1A和BMPR1B受体，而成肌腱分化仅依赖BMPR1B信号通路，为优化基于PDLSCs的牙周再生疗法提供了关键理论基础。
引言：牙周病是全球性的口腔健康问题，影响着20%–50%的世界人口，导致牙周韧带（PDL）、牙骨质和牙槽骨等支持组织的进行性破坏。牙周炎是牙周病最严重的形式，也是全球成年人牙齿丧失的主要原因。成功的牙周再生需要形态发生信号分子、反应性干细胞/祖细胞和适当的细胞外基质支架的协调整合。在潜在的干细胞来源中，牙周韧带干细胞（PDLSCs）因其在移植后能够再生牙骨质和PDL样结构而成为特别有前景的再生治疗候选者。骨形态发生蛋白4（BMP4）是转化生长因子-β（TGF-β）超家族的一员，在调节干细胞命运决定方面显示出巨大潜力。然而，BMP4信号通路如何驱动人PDLSCs（hPDLSCs）向特定细胞谱系分化的机制尚不清楚，尤其是其剂量依赖性效应。
单细胞转录组分析揭示hPDLSCs的异质性和BMP4介导的谱系偏向
为了深入了解hPDLSCs的多向分化潜能，研究人员分析了来自3名健康个体（年龄21-27岁）第三磨牙牙周韧带组织的公开单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集。通过无监督聚类识别出九个不同的细胞亚群，每个亚群表现出独特的基因表达模式，揭示了hPDLSCs内部的细胞异质性。值得注意的是，簇4细胞以表达IGFBP5（胰岛素样生长因子结合蛋白5）为特征，IGFBP5是牙髓间充质祖细胞的干细胞标志物。发育轨迹推断显示，所有亚群均来源于表达IGFBP5的簇4细胞，并沿着两个主要发育方向分化。研究人员进一步分析了关键调控因子RUNX2（成骨细胞主转录因子）和SCX（肌腱/韧带特异性转录因子）的表达模式。核基因加权密度估计显示，在簇4细胞中，较高的BMP4表达与较高的RUNX2表达相关，而较低的BMP4表达与较高的SCX表达相关。有趣的是，沿着两个主要发育方向，BMP4上调与RUNX2减少和SCX增加相关，暗示了BMP4对hPDLSCs谱系规范的剂量依赖性效应。定量分析证实，BMP4上调与RUNX2呈负相关（簇4→2→0），与SCX表达呈正相关（簇4→1→3）。这些结果揭示了hPDLSCs中先前未被认识的细胞异质性和发育可塑性，并表明BMP4以剂量依赖性方式调节成骨和成肌腱分化程序之间的偏向。
伪时序轨迹分析揭示hPDLSCs谱系规范过程中BMP4、RUNX2和SCX的双相表达动力学
为了进一步解析hPDLSCs谱系规范过程中BMP4、RUNX2和SCX的时间动力学，研究人员使用Monocle2重建了分化轨迹。轨迹分析确定了跨越四个分支点的九个不同的细胞状态。起源于表达IGFBP5的初始状态8，hPDLSCs分化为五个终末状态。BMP4在整个hPDLSCs分化轨迹中均有表达。对hPDLSCs分化过程中BMP4、RUNX2和SCX表达的特征描述揭示了一个一致的模式：在每个细胞状态转换开始时，BMP4表达较低，同时RUNX2和SCX表达均较高。在随后的状态转换中，BMP4逐渐增加，然后在除从状态8到状态5的分叉外的所有分支点下降，在该分叉处BMP4保持高表达。值得注意的是，在BMP4表达上调之后，RUNX2表达在所有分支点立即下降。相比之下，SCX表达立即增加，并且在除从状态2到状态1的分叉外的所有分支点，其保持升高的时间长于RUNX2。有趣的是，SCX表达在两个特定的分叉处达到峰值：从状态8到状态7以及从状态2到状态9。这些峰值出现在BMP4表达下降之后。hPDLSCs细胞状态转换过程中BMP4、RUNX2和SCX表达动力学的可视化进一步证实了这些观察结果。总之，这些结果揭示了hPDLSCs分化过程中BMP4、RUNX2和SCX表达的双相动力学：低BMP4表达与RUNX2和SCX的高共表达相关，而BMP4上调则与RUNX2表达呈负相关，与SCX表达呈正相关且动态的关系。这些发现进一步支持了BMP4在hPDLSCs谱系规范中的剂量依赖性调控机制。
BMP4对hPDLSCs谱系规范产生剂量依赖性效应
基于上述发现以及先前表明不同浓度BMPs差异性地调节hPDLSCs增殖和成骨分化的研究，研究人员进一步表征了hPDLSCs在低剂量（10 ng/mL）或高剂量（100 ng/mL）BMP4处理后的成骨和成肌腱分化潜能。值得注意的是，低浓度BMP4处理增加了SCX和RUNX2的表达，这与伪时序分析结果一致。为了确认BMP4直接介导这些转录因子的上调，研究人员用Noggin（一种已知的BMP4拮抗剂）处理hPDLSCs。此干预有效减弱了BMP4诱导的SCX和RUNX2上调。比较低浓度和高浓度BMP4的效果时，一个关键观察结果显现：相对于低剂量组，高浓度BMP4进一步增强了SCX表达，同时抑制了RUNX2表达，这与scRNA-seq分析结果一致。鉴于SCX表达与外源性BMP4处理以及hPDLSCs内源性BMP4表达水平呈正相关，研究人员接下来探究了SCX是否直接响应升高的BMP4。使用慢病毒过表达系统在hPDLSCs中上调BMP4，发现BMP4过表达使SCX的核积累增加了约2.5倍，直接证实了BMP4在驱动hPDLSCs向成肌腱谱系定型中的关键作用。总之，这些数据验证了BMP4对hPDLSCs谱系规范产生剂量依赖性效应：低BMP4浓度维持hPDLSCs多能性，而高BMP4浓度则促进成肌腱谱系定型同时减弱成骨分化。
不同的BMP受体对介导BMP4依赖性的hPDLSCs成骨和成肌腱分化
鉴于BMP4通过配体-受体相互作用启动信号转导，研究人员利用CellChat推断和分析hPDLSCs亚群（簇0-8）之间的细胞-细胞通讯，以理解高浓度BMP4的体外处理如何引发相反的成骨和成肌腱分化反应。对成骨亚群和成肌腱亚群中传入的BMP信号进行定量评估显示，这两种谱系的BMP4信号是通过不同的受体对转导的。在成骨hPDLSCs中，BMP4信号通过BMPR1A或BMPR1B与三种II型受体（BMPR2、ACVR2A、ACVR2B）之一配对进行转导。相比之下，成肌腱hPDLSCs利用BMPR1B与相同的三种II型受体（BMPR2、ACVR2A、ACVR2B）配对进行BMP4信号转导。基于这些发现，研究人员提出了一个机制模型来解释hPDLSCs响应体外BMP4处理时剂量依赖性的成骨和成肌腱分化。具体来说，成骨（RUNX2+）和成肌腱（SCX+）hPDLSCs之间的两个关键差异共同驱动了它们不同的分化反应：（1）不同的细胞表面BMP受体对，以及（2）BMP4上调时RUNX2和SCX表达变化的固有模式不同。
讨论
本研究对BMP4在hPDLSCs分化中的剂量依赖性效应进行了深入探讨。scRNA-seq分析揭示了内源性BMP4表达与谱系特异性转录因子之间的 distinct 相关性。轨迹分析揭示了hPDLSCs细胞状态转换过程中BMP4、RUNX2和SCX的双相表达动力学，共同表明了BMP4在hPDLSCs分化中的剂量依赖性调控机制。体外功能验证证实了这些观察：低剂量BMP4通过同时上调RUNX2和SCX来维持多能性，而高剂量BMP4则促进成肌腱分化并抑制成骨定型。一个关键发现是确定了谱系特异性的BMP受体利用，这表明受体靶向策略可以选择性地调节分化过程。除了BMP4的调控作用外，研究结果还揭示了hPDLSCs亚群中前所未有的异质性，这对将PDLSCs视为同质干细胞群体的传统观点提出了挑战。总之，本研究证实BMP4对hPDLSCs谱系规范产生剂量依赖性效应，并揭示了先前未知的细胞异质性，这两者对于改进再生疗法至关重要。
材料与方法
生物信息学分析：使用Seurat对公开的hPDLSCs scRNA-seq数据进行处理和无监督聚类。使用VECTOR推断发育方向。使用Monocle2重建hPDLSCs分化轨迹并进行伪时序分析。使用CellChat分析hPDLSCs亚群间的细胞通讯。
细胞分离、培养和处理：从福建医科大学口腔医学院医院收集的正常第三磨牙中分离hPDLSCs。细胞在含10%胎牛血清的DMEM中培养。使用第3-5代细胞进行实验。细胞在指定浓度和时间的BMP4、NOG或慢病毒（pNL-BMP4-IRES2-EGFP）处理下孵育。
RNA提取和实时定量PCR（RT-qPCR）：使用试剂盒提取总RNA并反转录为cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq进行RT-qPCR。基因表达水平以ACTB为内参进行标准化。
免疫荧光：hPDLSCs在玻璃盖片上培养，经慢病毒处理96小时后，用4%多聚甲醛固定。使用SCX一抗和Alexa Fluor-488标记的二抗进行染色，DAPI标记细胞核。使用显微镜获取图像。使用CellProfiler定量胞浆和核内SCX荧光强度。
结论
本研究揭示了hPDLSCs中先前未被认识的细胞异质性，并证明BMP4浓度可以在保持多能性的同时偏倚其分化结局，对hPDLSCs谱系规范产生剂量依赖性效应。这些发现为改进治疗慢性牙周炎的牙周再生疗法提供了宝贵的见解。
