引言
肿瘤日益增长的负担对公共卫生构成重大挑战，凸显了对更精确诊断方法的迫切需求。穿刺活检对于恶性肿瘤的组织学确认仍然不可或缺，是当前临床方案的基石。现有的临床穿刺引导成像技术，如X射线、计算机断层扫描（CT）、超声和磁共振成像（MRI），在提供宏观定位和引导活检程序方面发挥着关键作用。然而，这些模态仅能提供毫米至厘米级的分辨率，并且易受生理运动（如呼吸和心脏搏动）的影响，可能导致采样不准确、组织获取不足等问题，尤其对于小而复杂的肿瘤。将实时显微成像与常规宏观模态整合，以提供靶向病变的细胞级分辨率数据，从而实现更高的定位精度，是临床应用中高度期望的目标。
为了在经皮活检过程中最大限度地减少组织损伤，活检针的持续微型化（例如内径为250 μm的25号（25 G）临床标准）对成像探头提出了小于250 μm直径的挑战。尽管出现了诸如受激拉曼散射（SRS）显微镜、双光子和多光子成像、结合癌症靶向近红外（NIR）示踪剂的共聚焦激光显微内镜以及短波红外光热显微镜（SWIP）等新兴模态，但其临床转化仍受限于探头尺寸的不兼容性。
AIM穿刺针的性能
研究团队开发了一种人工智能赋能的集成光场显微内镜（AIM）穿刺针，克服了光学元件尺寸与成像分辨率之间固有的权衡。该探头采用临床兼容的封装，将一根125 μm的多模光纤（MMF）集成在临床标准活检针内，建立了一个活体光传输通道，同时保持了结构完整性。通过传输矩阵实时校准和焦平面优化的协同控制，系统在整个穿刺轨迹中实现了衍射极限的细胞分辨率（图1）。AIM穿刺针（图2A）利用数字微镜器件（DMD）生成的Lee全息波前整形和CMOS离轴干涉测量法动态解析多模光纤传输矩阵，在光纤端面实现动态聚焦。刚性耦合架构减少了相对位移误差，确保了光学焦点与组织穿透轨迹之间的精确空间配准。此外，在穿刺过程中，系统基于当前状态检索3D传输矩阵（TM）来对多个焦平面成像。通过使用Brenner函数计算不同平面的图像清晰度度量，它选择最佳焦平面以锁定焦点，在整个穿刺过程中保持成像分辨率。分辨率量化使用标准化测试靶标证明，系统能够分辨450线对每毫米（lp mm-1），最小可分辨特征尺寸为1.2 μm（图2B-D），实现的分辨率性能接近由0.37数值孔径（NA）探头配置预测的理论衍射极限。
AIM穿刺针的活体成像区分正常与肿瘤组织
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，迫切需要通过成像技术进步对毫米级肺部恶性肿瘤进行精确早期诊断。然而，微型成像辅助的常规CT引导下毫米级肺部病变活检面临持续挑战，包括因呼吸运动伪影和采样不准确导致的不可忽略的假阴性率，以及无法分辨对靶向至关重要的微观结构特征。AIM穿刺针可能通过提供细胞级、实时活体显微成像来动态区分异质性组织（正常与肿瘤），为这一未满足的临床需求提供了一种有前景的微观水平补充途径。
AIM穿刺针实现了实时活体显微成像，并具备初步区分肿瘤与健康组织的能力。为了证明其性能，在正常小鼠和Lewis肺癌（LLC）荷瘤模型中进行了活体穿刺成像，使用临床批准的荧光染料吲哚菁绿（ICG）来增强信噪比（SNR）和成像对比度（图3A）。AIM穿刺针显示，当活检针到达正常肺组织的终末肺泡时，会遇到形状规则、大小相似的圆形至椭圆形空隙，其边界由ICG增强的毛细血管勾勒（图3B）。充气肺泡表现为均匀的暗区，而肺泡间隔则由于灌注毛细血管中ICG的积聚而表现出显著的荧光增强。固有的肺泡-间质对比度使得在针插入过程中能够进行实时可视化。
当针接近肿瘤边缘的可疑区域时，肺泡结构逐渐变得杂乱和不规则。进入肿瘤核心后，肺泡排列被破坏，甚至可能呈现堆叠样模式（图3C）。随着穿刺深度的变化，肺泡的大小和形状持续变化，直到肺泡结构变得无法辨认（图3D）。AIM穿刺针成像显示，肿瘤细胞浸润导致肺泡结构的逐渐消失，使肺泡结构变得模糊不清——这与可辨别完整肺泡结构的正常肺组织形成鲜明对比。需要注意的是，在实际临床实践中，肿瘤和正常组织可能缺乏清晰的分界。单独依赖AIM可能无法达到理想的区分效果，因此需要与多模态显微成像技术或其他辅助方式整合以实现准确判别。
多个小鼠内脏器官的穿刺成像
除了肺部，本研究还将穿刺实验扩展到多个小鼠内脏器官，包括甲状腺、心脏、肾脏和肝脏，以验证AIM穿刺针的跨器官适用性。在甲状腺穿刺过程中，系统检测到大小不一的圆形/椭圆形结构，显示可忽略的荧光，周围是荧光增强区（图4A）。这些低荧光区域被假设对应于甲状腺滤泡腔内的胶体成分，而荧光周边区域则对应于微血管丰富的结构。ICG循环过程中的血管密度梯度在这些区域之间产生了差异化的荧光信号。AIM穿刺针捕获的胶体成分和相邻空泡结构的空间分布特征与H&E染色的解剖结构一致，支持其分辨甲状腺微观结构特征的能力。
心脏是一个具有致密肌肉壁的空心器官，主要由心肌细胞组成。AIM穿刺针探头的穿透能够清晰显示心肌结构（图4B），揭示了两种主要的截面视图：显示心肌细胞束平行排列的纵切面，以及显示多边形细胞轮廓的横切面。在整个心肌区域观察到纤维直径和空间密度的细微区域差异。
肾小球，也称为血管球，由鲍曼囊内的毛细血管簇组成。ICG在循环过程中主要分布在血管内，这解释了穿刺成像过程中中央区域的显著荧光增强（图4C）。穿刺针穿透更深后，可以观察到环形结构，这些结构与属于肾小管的薄段一致。随着穿刺针进一步推进，可以看到排列更松散的结构，对应于集合管（补充图S3D）。
穿透肝被膜后，可以观察到大小均匀、排列紧密、荧光强烈的板状结构（图4D）。随着针进一步推进，可见混合的索状结构。前者提示为肝小叶，后者则提示为肝小叶内的微血管通道。
胃肠道的管腔内穿刺成像
胃肠壁由四个不同的组织学层组成：粘膜、粘膜下层、肌层和浆膜（食管最外层为外膜），每层都具有特殊的生理功能。虽然传统内镜仅限于观察管腔表面，但我们的AIM穿刺针探头通过内镜辅助通道输送，展示了动态全层结构可视化的潜力。在此框架内，我们在小鼠胃肠道中实施了深度相关的穿刺成像，捕获了层特异性结构特征：粘膜和肌层具有固定的方向和独特的纹理，而粘膜下层和外膜则表现出不均匀的纹理组织。这些层间结构差异支持在成像过程中将实时穿透深度与解剖分层相关联。
穿刺成像显示了小鼠食管中独特的层特异性特征（图5A）。粘膜层呈现带状堆叠结构，归因于复层鳞状上皮。粘膜下层区域显示短暂的明亮条纹，对应于疏松结缔组织内的血管。在更深穿透处，出现规则排列的条纹，与肌层纤维方向一致。外膜层显示具有类似粘膜下层结构特征的血管信号。
小鼠胃由腺体和非腺体区域组成，腺体胃根据粘膜上皮细胞类型进一步分为贲门、胃底和幽门。胃底部的穿刺成像显示圆形、暗色、实性结构，周围环绕荧光信号，提示为胃小凹和胃腺。随着针的推进，出现不规则的明亮信号，指示粘膜下层。进一步穿透显示条带状或扇状结构，与肌层的肌纤维一致。在最深点，观察到明亮信号，对应于主要由疏松结缔组织组成的外膜（图5B）。
在小肠穿刺成像过程中，首先观察到条带状和颗粒状荧光信号结构，代表粘膜层中多样的绒毛形态。随着针推进超过绒毛，粘膜下层出现规则排列的圆形结构，为布伦纳氏腺的特征。进一步穿透肠壁后，揭示出条带状、有序排列且具有方向性的结构，推测为肌层的环肌和纵肌。最后，观察到不规则结构，可能对应于疏松结缔组织、血管以及外膜层的其他成分（图5C）。
在结肠穿刺成像过程中，最初观察到明显的圆形、暗色结构，周围环绕荧光信号，指示为结肠隐窝。穿刺针穿过隐窝结构后，可见条带状结构，代表粘膜下层的血管和其他成分。随着针进一步推进至肠壁，出现交织、规则排列的结构，推测为肌层的环肌和纵肌。最后，观察到不规则结构，可能对应于疏松结缔组织、血管以及外膜层的其他成分（图5D）。这些分层结构逐渐变得可见。
代表性器官的深度分辨穿刺成像
AIM在组织穿行过程中捕获了不同穿透深度的断层特征。成像深度与穿刺进程精确相关，揭示了心脏组织、健康肺组织和肺肿瘤的3D结构细节：针推进过程中心肌结构的变化（图6A,B）；正常肺实质中有组织的微观模式（图6C,D）；以及肿瘤区域无序的异质性（图6E,F）。这种深度分辨成像方法为活检定位提供了微米级空间引导，显示出提高诊断和治疗干预精度的潜力。
AIM穿刺针同时获取不同深度的实时显微图像，并记录活检过程中的针推进情况，从而在成像空间坐标与针轨迹之间建立映射。该系统能够实时监测沿穿刺路径的微观结构变化，确保对病变的高精度靶向。通过整合多深度和多位置成像数据，有望重建3D肿瘤模型，这对于预测肿瘤浸润模式具有潜力。
正常与肿瘤组织的维度差异
准确区分正常肺组织和肿瘤图像对于指导穿刺采样区域的决策至关重要。荧光强度和灰度分布分析显示，肿瘤区域具有较高比例的高灰度值，而正常组织主要集中在下灰度范围（图7A,B）。
空间和频率域指标的定量分析进一步揭示了一致性的差异（图7C-I）。在空间域，肿瘤表现出显著更高的对比度和显著更低的同质性，表明微观结构不规则性增加。在频率域，平均幅度谱和高频能量在肿瘤中均较高，反映了精细尺度内容的增加以及频谱分布向更高径向频率的偏移。频谱频率对比度（质心高频变体）进一步突出了能量向更高径向频率的转移。频谱频率方差更高，表明跨径向频率的频谱能量分布更广。所有六个指标在图中均满足Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR）控制（q < 0.05；星号仅表示通过/未通过，无分级），效应量从中等到非常大（Cliff‘s delta）。总的来说，这些指标可靠地区分了肿瘤与正常组织，突出了显著的空间异质性和独特的频谱特性。
本研究开发了一个结合主成分分析（PCA）进行降维和K均值进行聚类的无监督学习框架，t分布随机邻域嵌入（t-SNE）仅用于可视化。利用强度分布特征作为主要维度，该框架实现了穿刺图像的自动分类，可视化结果清晰描绘了不同簇的空间分布模式（图8A）。通过多尺度边缘检测算法进行特征提取后，采用可视化功能直观显示聚类结果（图8B）。
本研究采用基于强度分布和边缘特征的K均值聚类，实现了正常组织和肿瘤组织之间的有效区分。然而，单特征分析显示出诊断局限性：基于强度分布的聚类实现了高精度，但误分类了一些正常肿瘤图像，而基于边缘特征的聚类在组织解释上表现出类似的诊断差异（补充表S2）。尽管如此，这两个特征在分类过程中表现出显著的互补效应。对典型误分类案例的分析表明，绝大多数基于结构特征误分类的图像可以利用强度分布特征准确分类，反之亦然（图8）。这种双特征分类的协同组合对于降低假阴性率尤为关键。
为了提高分类精度，我们利用监督学习机制和卷积神经网络（CNN）进行正常和肿瘤组织的区分。数据集通过五折分层交叉验证进行评估，实现了近乎完美的性能。主成分分析（PCA）和t-SNE可视化验证了健康/肿瘤区域之间的特征可区分性，为实时穿刺判断提供了可靠支持（图9）。
讨论
AIM穿刺针在小鼠穿刺活检过程中实现了实时活体高分辨率成像，实现了跨器官可视化。该技术解析了器官特异性微观结构：肺泡、心肌结构、肾小球、肝小叶以及中空器官的分层结构（如粘膜、粘膜下层、肌层和外膜）。对于肿瘤，它捕获了边缘纹理不规则性和核心结构紊乱，支持异质性分析。与仅提供宏观穿刺引导的临床成像模态（超声、CT、MRI）不同，AIM穿刺针将125 μm成像探头集成到活检针组件中，展示了实现双尺度可视化（宏观导航结合实时细胞分辨率成像）的潜力。这种集成系统在获取活检轨迹上细胞级组织特征的同时，展现出精确靶向病变的潜力，为精准介入诊断补充了一条潜在的新技术途径。
AIM穿刺针成像的空间/频率域定量分析揭示了肿瘤与正常组织之间的明显差异（图7）。从空间角度来看，肿瘤组织显示出更高的对比度和更低的同质性，反映了内在的微观结构紊乱——例如异常增殖导致的结构破坏、紊乱的细胞外基质以及异质性的细胞密度和分布。这些模式与恶性进展一致。在频率域，肿瘤的平均幅度谱和高频能量升高，表明由复杂微观结构产生的精细尺度内容增加，从而产生更强的高频分量。频谱频率方差更高，表明跨径向频率的频谱能量分布更广。频谱频率对比度进一步突出了能量向更高径向频率的转移。这些发现与肿瘤异质性研究一致，验证了AIM穿刺针量化细胞尺度病理生理学特征的能力。这些定量指标提供了客观的区分标准，补充了传统的视觉评估方法。
在聚类算法中，将无监督聚类与监督CNN相结合的级联架构，支持从低层特征解析到高层判别建模的逐步优化，实现了实时、高精度的分类（补充图S4，补充视频S1和S2）。这条协同光学特性与深度特征提取的技术路径，为降低活检采样中的假阴性风险提供了一种潜在的缓解策略。
通过利用多模光纤（MMF）的独特特性，AIM穿刺针在活检过程中获取不同深度的实时微米级分辨率图像。通过3D重建，这些图像生成类似组织学的微观结构信息，其分辨率超过临床CT/MRI，同时支持术中实时采集。在未来研究中，我们将通过电机驱动、编码器同步推进的方式采用严格统一的轴向采样，以构建度量精确的3D微病变图谱。这种3D显微成像引导提供了组织结构和细胞形态的详细空间关系。与传统的活体CT/MRI断层扫描相比，该技术显著提高了空间分辨率；与离体组织病理学诊断的金标准相比，它实现了实时活体显微扫描诊断，从而突破了诊断成像的现有技术障碍。在临床上，该方法有潜力帮助医生直接术中可视化病变内的微观结构特征，提高毫米级病变活检的采样准确性，并通过集成分类算法提供实时初步诊断以缩短诊断周期。需要强调的是，该成像技术并非替代组织病理学检查，而是旨在为临床穿刺程序提供一种无创的细胞级补充成像方法。
然而，AIM穿刺针存在固有局限性：前向成像视场（FOV）受扫描角度、工作距离和清晰孔径的限制；适度增加工作距离可以扩大FOV；此外，尽管系统目前在785 nm波长下实现了微米级分辨率，但优化照明波长和数值孔径（NA）可将分辨率提高到亚微米水平。除了FOV扩展和分辨率优化之外，未来发展的一个关键方向在于显著提升成像速度。这可以通过实施高速扫描机制、采用压缩感知策略减少数据采集时间以及开发针对感兴趣区域进行高分辨率成像的反馈驱动自适应采样来实现。这些改进共同旨在缩短操作时间并增强系统的动态跟踪能力。这些改进将推进临床转化，为经皮活检中的宏观引导提供补充解决方案。
AIM穿刺针的未来发展将遵循从技术验证到广泛临床应用的逻辑进程。初始步骤将侧重于建立“虚拟H&E”研究，实现活体光学特征与病理学基准更直接、定量的关联。在此基础上，整合肿瘤特异性荧光探针作为关键分子标记物，有望通过提高组织特征识别的特异性，显著增强亚细胞水平自动组织鉴别的准确性。利用这些增强功能，我们将把应用范围扩展到涵盖TNM分期I-IV期不同肿瘤类型（腺癌、鳞状细胞癌）的多器官成像。这一扩展旨在捕获分期特异性病征成像特征，从而促进构建全面的肿瘤学图像库。AIM穿刺针的显微成像与宏观活检引导的整合，有望在组织采样过程中实现双路径验证，从而通过协同多尺度检测系统性减少假阴性事件。
结论
本研究开发了一种AIM穿刺针，通过光-机-电协同创新，克服了微创介入与细胞分辨率成像之间的限制。该探头在活体穿刺过程中建立了稳定的光传输通道，并通过实时传输矩阵校准和闭环焦平面优化，在整个穿刺轨迹上实现了衍射极限分辨率。空间-频率协同表征结合深度学习算法，实现了肿瘤与正常组织的自动判别。AIM穿刺针有潜力将细胞级成像无缝集成到标准活检工作流程中，为精准早期肿瘤诊断提供了一种新途径。
方法
实验设计
本研究旨在开发和验证AIM穿刺针，以实现小鼠的实时活体穿刺成像。实验对象包括正常小鼠（n = 32）和原位肺肿瘤小鼠（n = 6）。使用AIM穿刺针，我们在进行穿刺成像的同时记录穿刺深度，以建立不同深度下的特征结构和分层微观结构。通过与传统的离体细胞分析方法比较，我们评估AIM穿刺针在实时活体穿刺成像中的性能。获得的图像数据将进行统计分析和量化，以获得相关的统计结果。主要终点包括成功获取不同深度下的特征结构和分层微观结构，次要终点是使用定量分析区分肿瘤和正常组织，以提高诊断效率和准确性。
AIM穿刺针的性能
测试探头（NA = 0.37）和针集成探头（NA = 0.22，补充图S5）均提供接近衍射极限的分辨率和大约百微米尺度的视场（FOV）。我们制备了ICG稀释液，其在785 nm激发下发射的荧光由光电倍增管（PMT）检测。调整参考光与物光的光强比实现了最佳干涉效果，从而最大化穿刺针成像对比度。使用平移台的精细调节旋钮实施精确的深度控制，随后通过算法进行荧光信号采集和图像重建。
样品制备
本研究共使用了38只C57BL/6小鼠（4-5周龄，约20 g）。所有小鼠均在无特定病原体（SPF）条件下饲养。小鼠分为两组：32只健康小鼠购自杭州杭仕生物技术有限公司，6只荷瘤小鼠购自浙江医芬生物技术有限公司。肺荷瘤小鼠的生成如下：使用的肿瘤细胞来自LLC细胞系（小鼠肺癌，研究资源标识符（RRID）：CVCL_4358），细胞活力>95%并确认无污染。通过尾静脉注射100 μL浓度为1 × 107个细胞的肿瘤细胞悬液，使细胞到达肺组织。注射后约3-4周内形成肿瘤。在用于建模的6只小鼠中，五只成功形成肿瘤（成功率83.33%）。肿瘤分布在肺部，直径范围1至5.2 mm，表明存在个体间差异。此外，使用了一只结肠肿瘤小鼠（CT26.WT细胞系，RRID：CVCL_7256，确认无污染）。在建模的一只小鼠中，一只成功形成结肠肿瘤（建模成功率100%），成像时病变大小约为2.0-4.5 mm。最终的实验队列包括六只荷瘤小鼠和32只健康小鼠。
生物样品成像和后处理
为了增强组织对比度，使用了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的吲哚菁绿（ICG），其激发/发射波长为785/810 nm。通过尾静脉注射ICG（最终浓度0.5 mg mL-1），20 g小鼠注射0.6 mL（总量0.3 mg；15 mg kg-1）。基于ICG药代动力学特性，在战略定义的器官特异性时间窗口内进行活体荧光成像，以确保一致的信号采集（补充图S6）。以ICG主要代谢器官肝脏为例，成像窗口设定在注射后15-30分钟。这种方法有效最小化了不同组织间灌注和排泄速率差异引起的成像变异。戊巴比妥钠确保制动。探头安装在25号针内，根据目标器官深度/位置选择穿刺点和轨迹，以便在穿透过程中进行精确成像。
穿刺路径经过预先规划以避开大血管并便于操作；在健康小鼠中，优先选择具有典型结构的区域，在荷瘤小鼠中，轨迹指向肿瘤核心。AIM穿刺针以受控的暂停-观察-推进节奏前进，并根据组织阻力动态调整速度。
AIM穿刺针在针推进过程中捕获实时组织动态。操作后，器官在-80°C速冻，并在2小时内送至病理实验室进行冰冻切片，通过H&E染色验证光学成像数据。
图像处理与重建
图像处理流程始于多模光纤（MMF）传输矩阵的校准。利用数字微镜器件（DMD）调制MMF入射波前的相位，消除或减轻由MMF引入的光场畸变。入射到MMF上的
