《Advanced Science》：Microgel-Based Hierarchical Porous Hydrogel Patch with Adhesion and Resilience for Myocardial Infarction
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本综述系统介绍了基于微凝胶模块化制造策略开发的多级孔微凝胶水凝胶贴片（HPMP），该技术通过气动剪切微流控结合双水相系统（ATPS）制备可调孔隙的微凝胶，并进一步通过3D生物打印构建具有层次孔结构的功能贴片。HPMP展现出优异的组织黏附性、机械回弹性及促进细胞迁移与血管网络形成的能力，在心肌梗死（MI）模型中有效促进心肌再生并抑制胸腔粘连，为组织工程与再生医学提供了创新平台。
1 引言
水凝胶支架在组织工程与再生医学领域应用广泛，但传统块状水凝胶受限于纳米级分子交联网络，阻碍营养扩散与细胞迁移。3D生物打印技术虽能精确控制水凝胶结构，但挤出式打印过程中的机械剪切应力会损害细胞活性。微凝胶因其微米级尺寸和高比表面积成为新型生物材料，然而传统微凝胶的高交联聚合物网络仍限制细胞迁移和细胞外基质（ECM）重塑。已有研究通过冷冻干燥或化学合成制备多孔微凝胶，但存在细胞毒性、结构不稳定等局限。双水相系统（ATPS）因其温和、环保且能快速自发形成多孔结构而成为有前景的替代方案。然而，传统微流控制备需引入有机相，可能降低生物相容性。此外，纯微凝胶材料的打印精度受粒径分布、机械强度等因素限制，导致层间结合力不足。
心肌梗死（MI）作为严重心血管疾病，导致心肌细胞丢失、炎症激活、纤维化瘢痕和血管化不足。现有药物和介入治疗仅缓解症状，无法逆转心室重构。干细胞疗法虽具潜力，但存在细胞滞留率低、整合效率差等问题。生物材料如块状水凝胶或微凝胶可提供结构支持，但孔隙结构调控不足、机械性能不匹配等问题限制其疗效。因此，开发能同时促进细胞迁移、血管生成和组织重塑的多功能生物支架至关重要。
本研究提出一种模块化制造方法，通过两阶段微凝胶制备工艺构建多级孔水凝胶贴片（HPMP）。该策略以明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）为生物墨水连续相，聚环氧乙烷（PEO）为牺牲相，与海藻酸盐（Alg）多孔微凝胶混合。首先，通过ATPS与气动剪切微流控技术制备多孔Alg微凝胶；其次，以微凝胶为结构单元进行3D打印，获得具有层次孔结构的HPMP。该贴片具备机械黏附性、回弹性及良好细胞行为，支持细胞迁移和血管化。为验证其生物医学应用潜力，研究将其用于心肌梗死治疗，通过负载诱导多能干细胞（iPSC）的微凝胶诱导心肌细胞分化，并利用甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）构建Janus结构贴片（JHPMP）防止胸腔粘连，优化心肌修复效果。
2 结果
2.1 通过双水相系统制备多孔微凝胶
为构建促进细胞生长和迁移的多孔微凝胶，研究结合气动剪切微流控策略和ATPS，生成具有高度互联微孔结构的微凝胶。通过室温混合Alg-葡聚糖（Dex）预凝胶溶液与PEO形成细胞负载的ATPS生物墨水，稳定双相分层证实ATPS成功形成。共聚焦成像显示PEO在Alg-Dex溶液中形成离散液滴，交联后形成多孔网络。扫描电子显微镜（SEM）图像进一步证实微孔结构。通过引入聚乙二醇（PEG）作为稳定剂到收集浴中，系统优化Ca2+/PEG浓度梯度，发现1% PEG可实现球形微凝胶形成。多孔微凝胶具有高单分散性，内部呈现明确多孔结构，与纯Alg微凝胶的非孔结构形成对比。通过调节喷嘴直径和气体流速等参数，可精确调控微凝胶直径在100至700 μm范围内。
基于ATPS的可调性，可通过调节相浓度、组分比例和凝胶时间精确控制孔隙大小和孔隙率。当增加Dex浓度（连续相，固定2% PEO）时，孔隙率成比例增加；提高PEO浓度同样增强孔隙率。体积相比例优化显示最大孔隙率出现在3:2比例。延长ATPS静置时间进一步增加孔隙率。这些参数使微凝胶孔隙率在17%至60%范围内可调。
2.2 多孔微凝胶的细胞行为
通过气动剪切微流控和ATPS的无油处理保持高细胞活性，研究直接将细胞封装在生物墨水中制备多孔微凝胶。细胞分布均匀，培养24小时后显示优异细胞活性。将人宫颈癌细胞（HeLa）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和大鼠心肌细胞（H9C2）封装于多孔微凝胶中，所有细胞在7天后均保持高活性，并逐渐扩展为纺锤形形态。与负载细胞的非孔1.5% Alg微凝胶相比，多孔微凝胶在14天后维持更高细胞活性。H9C2在微凝胶内表现出强劲增殖和迁移能力。通过Live/Dead染色、CFSE和PrestoBlue实验评估细胞活性和代谢活性，显示H9C2细胞逐渐从微凝胶中迁移出来，并保持强代谢活性。HUVEC负载微凝胶显示显著细胞增殖效果。
通过调节ATPS参数，可重复制备具有可调孔隙率的均匀多孔微凝胶。在不同孔隙率（17%至58%）下培养H9C2细胞7天，细胞均保持高活性。微凝胶形态变化（椭圆形和滴形）对增殖或活性无显著影响。评估HUVEC负载多孔微凝胶的迁移能力，显示细胞在14天内向外迁移，28天完全脱离微凝胶并持续增殖。F-肌动蛋白染色显示细胞生长和重组，CD31表达增强并共定位于迁移细胞，确认功能生物活性。HeLa负载多孔微凝胶在7天内完全迁移并黏附于培养皿，进一步证实多孔微凝胶作为细胞增殖和迁移的稳健平台。
2.3 微凝胶基生物墨水的可打印性
为实现组织模拟细胞聚集体而非分散细胞群，研究开发了一种新型多级孔水凝胶生物墨水，以多孔微凝胶优化层次结构和细胞相互作用。通过优化GelMA-PEO系统与多孔微凝胶（GelMA-PEO-PMG），实现直接微凝胶基3D打印。流变学表征显示，生物墨水在低频区损耗模量（G″）超过储能模量（G′），呈现较高流动性；在高频区（G′ > G″）呈现凝胶行为，表明其在生物打印过程中具应用潜力。温度扫描测试显示生物墨水具有热敏凝胶化特性，转折点约20°C，低温下（G′ > G″）具稳健凝胶特性，有助于打印过程中结构完整性。黏度评估显示从0°C至40°C逐渐下降，在30°C–35°C稳定在平台期，相对于纯GelMA的持续下降，生物墨水黏度稳定性暗示其在挤出过程中保持流动性，同时打印后促进结构刚性。
将生物墨水应用于挤出式生物打印，通过GelMA的热响应特性促进可逆物理交联。评估微凝胶基生物墨水的挤出打印行为，表征细丝形态与GelMA浓度（2.5%–15%）和GelMA:PEO-PMG比例（2:3–3:2）的参数梯度。实验表明，GelMA浓度超过5%促进增强物理交联，实现连续稳定挤出和细丝形成；低浓度（<5%）显示凝胶不足，导致不连续液滴挤出。高PEO含量增加微凝胶在喷嘴处的聚集，诱发喷嘴入口卷曲和间歇流动阻塞。在10% GelMA以上，生物墨水在大多数混合比例下呈现均匀细丝形成，除非GelMA:PEO-PMG比例超过2:3诱发微凝胶聚集卡在喷头。图案打印实验证实上述结论。优化GelMA浓度（≥10%）和PEO-GelMA相比率是关键，以平衡固化动力学和流动特性，从而开发出具有增强可打印性和结构保真度的新型生物墨水。使用优化GelMA-PEO-PMG生物墨水可直接打印多种代表性3D结构，包括圆柱结构、空心圆柱结构、窄空心圆柱结构、网格晶格结构和太极结构。通过微凝胶结合红色荧光纳米颗粒和GelMA基质绿色荧光表征打印架构内部结构，显示光交联后具有明显多级孔结构，SEM进一步证实层次孔隙率的稳定保留。
扩展微凝胶基生物墨水的多功能可打印性，采用数字光处理（DLP）打印制造具有可设计特征的复杂结构。通过分析打印结构与计算机辅助设计（CAD）模型之间的偏差，系统评估可打印性。GelMA-PEO-PMG溶液在恒温打印平台上通过DLP打印机制造手骨模型。类似挤出生物打印，2.5% GelMA因光交联不足无法支持可行打印；降低PEO-PMG相比例部分恢复结构完整性，5% GelMA配方仍显示持续碎片化；最佳性能在10% GelMA实现，所有测试相比率均基本形成手骨，GelMA:PEO-PMG比例为1:1和2:1时呈现最高形态保真度。增加GelMA浓度至15%在所有比例下诱发过度交联，特别是3:2 GelMA:PEO-PMG配方导致完全结构融合。可打印性地图指示可打印区域，结论性确定10% GelMA与PEO-PMG比例1:1或2:1为DLP生物打印最佳条件。利用此优化配方和打印参数，制造具有复杂内部和外部架构的代表性3D结构。成功打印具有明显多孔结构的手骨模型，验证DLP打印结构内的层次孔隙率。此外，成功打印空心五角星状套娃结构，验证生物墨水生成复杂3D多孔支架的能力。进一步研究复杂模型可打印性，分别采用广州医科大学校徽、“GZMU”和“Tang Lab”缩写CAD模型，包含环形框架和中英双语空心字母，显示打印模型具有交织内部结构、缩小比例结构和清晰边缘。制造具有嵌套架构、生物结构和空心边缘的复杂特征，证明GelMA-PEO-PMG生物墨水的可打印性，同时突出微凝胶基策略在定制患者特异性组织支架方面的潜力。打印模型内的层次孔架构为再生组织工程应用提供关键细胞微环境平台。为阐明打印结构的细胞行为，研究对打印后培养的细胞负载微凝胶生物墨水进行活死 assay和免疫荧光染色评估细胞形态和活性，显示支架在培养七天后具优异细胞相容性，在生物材料基质内呈现良好扩展行为。
2.4 多孔微凝胶和HPMP的黏附性与回弹性
生物制造结构的机械性能 critically 影响组织工程应用，特别是适应动态组织收缩的回弹性和促进组织再生的黏附特性。通过循环压缩测试（1 N负载，50%应变，室温）使用SMS质地分析仪表征多孔微凝胶和HPMP。多孔微凝胶在循环加载下呈现高可逆响应性和优异压缩恢复性，与非孔藻酸盐对照相比，维持尺寸参数和孔结构与原始松弛状态相当。经过100次压缩循环后，多孔微凝胶显示良好形状压缩曲线，最大应力保留87.5%，并呈现显著降低的杨氏模量。这种增强回弹性源于微孔架构内的应力适应结构变形，其中微孔结构坍塌消散机械能而无断裂，实现负载移除后近乎完全形状恢复。
同时，循环压缩测试显示HPMP呈现高度可逆弹性恢复，而纯GelMA水凝胶发生不可逆变形。HPMP结构在加载循环间维持结构形态，无渐进损伤累积或结构坍塌。压缩过程中，多孔结构沿压缩应力收缩并在径向通过横向伸长缓冲外部应变，表现为压缩横向孔径增量。在50%压缩应变下100次循环，HPMP保持一致压缩曲线，最大应力保留94.6%，杨氏模量升高。稳健压缩性能不限于立方结构，延伸至半环形打印结构，在重复机械加载下维持生物打印结构完整性。HPMP的高可逆弹性可能归因于微米级多孔架构，结合结构回弹性和弹性行为。
完全压缩测试后分离时，HPMP在测试探针和测试平台间呈现黏附性，循环压缩应力-时间曲线每个循环显示两个回弹峰，可能指示 distinct 黏附事件。因此，研究假设HPMP具有优异黏附性能。调查HPMP黏附性能，首先进行材料黏弹性表征。与纯GelMA相比，HPMP呈现显著应力松弛行为，使材料能适应连续循环变形，有效消散局部应力集中，减轻界面分层，确保耐久稳定附着。进一步评估HPMP黏附能力，对黏附于组织的HPMP进行剪切-拉伸测试。结果显示GelMA呈现最小黏附效能，而HPMP在GelMA与PEO比例1:1时呈现显著优于2:1和1:2比例的拉伸性能。此增强可能归因于材料的多级孔架构，促进符合组织表面微尺度粗糙度，允许快速吸水、膨胀和软化。孔的部分坍塌可能在水凝胶和组织间产生负压区，从而增加有效接触面积并增强整体黏附性能。此外，HPMP的GelMA基质富含酰胺、氨基和羧基等官能团，可与心肌组织表面ECM蛋白质形成氢键、静电相互作用和疏水关联，进一步强化界面黏附强度。为验证黏附性，随后在生理相关加载下评估多孔水凝胶贴片的界面结合性能。HPMP显示稳健心脏黏附性，在摇动下抵抗机械位移。跨多样生物基质的黏附评估进一步证实这些特性。HPMP稳定近似切开的心脏组织，并在倒置条件下维持多器官标本与玻片黏附超过6小时。为进一步验证其在生理组织中的黏附性，挑战在搏动心脏上应用HPMP，显示在心肌搏动期间HPMP与心脏表面保持稳定黏附。这些结果确立HPMP的层次孔架构赋予优异机械能力和长期组织黏附性。此微凝胶基平台可能通过减轻贴片脱离同时适应生理收缩推进再生策略。
2.5 HPMP的生物学功能
工程修复贴片中的细胞迁移对修复不可逆损伤组织至关重要。为评估HPMP中的细胞行为，研究使用HUVEC负载多孔微凝胶生物墨水生物打印结构并维持培养21天。HPMP内HUVEC活性通过活死 assay确认。F-肌动蛋白免疫荧光染色用于验证HUVEC的迁移和形态。细胞呈现顺序组织化进展，特征为4天出芽、7天细胞迁移、14天建立血管样腔隙、21天最终形成紧密互联网络。CD31标记进一步证明功能维持，显示7天前表达水平逐渐增加，21天时呈现均匀分布和紧密腔隙结构。这些结果揭示HPMP架构在支持细胞从微凝胶迁移至整体结构的同时保持生物/细胞相容性和生物功能。功能维持表达推测HPMP暗示再生应用中血管化潜力。
功能性血管网络建立对工程组织存活和功能至关重要，因其实现关键营养/废物交换和血流灌注。为评估HPMP支架的血管化能力，将HUVEC接种于无细胞结构上并培养21天。HUVEC在4天内通过层次孔结构从表层浸润至HPMP，7天时通过活死 assay进展至腔隙形成。为进一步确认HPMP内血管化，F-肌动蛋白和CD31染色显示7天时HPMP内初步腔隙，随后14天沿多孔微凝胶和孔网络迁移，21天时在整个层次架构内紧密血管化。这些腔隙呈现渐进CD31扩展和伸长，21天时具明显闭合腔隙结构。纵向荧光图像进一步证明腔隙结构空心直径从14天20.31 ± 0.71 μm至21天51.73 ± 3.40 μm，具闭合环形配置。这些结果表明HPMP的层次孔结构支持外部内皮细胞浸润、迁移和血管化，提供先进组织再生平台。
2.6 微凝胶基水凝胶贴片在大鼠MI模型中的功能评估
基于细胞疗法利用功能性心肌细胞已成为心肌修复的有前景治疗策略。然而，这些方法面临两个基本挑战：（1）在 hostile 后缺血微环境中细胞存活和增殖有限，特征为氧化应激和炎症；（2）实现移植心肌细胞与宿主组织功能同步化困难。工程生物材料支架可重建生理微环境以增强细胞疗法疗效。然而，当前心脏贴片常缺乏有效细胞递送和血管化，同时需要手术缝合稳定支架，风险组织黏连。因此，开发能同时实现心肌再生、功能性血管化和抗黏连的多功能心脏贴片 presents 心脏组织工程中的艰巨转化挑战。鉴于上述已建立微凝胶基系统优势，我们的制造策略预期为结构和功能组织再生提供潜在生物医学平台。
为工程心肌修复贴片，研究利用iPSC制备心脏工程微凝胶并评估其心肌细胞分化潜力。iPSC负载多孔微凝胶培养7天，随后15天定向心肌细胞分化。iPSC在多孔微凝胶内初始培养期间维持>90%活性，心脏分化全程保持高活性。心脏肌钙蛋白T（cTnT，心肌细胞标志蛋白）染色在15天进行以确认成功iPSC分化。细胞在多孔微凝胶内心脏分化后呈现强劲cTnT表达。为调查渐进分化，在特定时间点从iPSC负载多孔微凝胶提取细胞，用心脏标志进行系统评估。控制微凝胶溶解使用乙二胺四乙酸（EDTA）——一种 established 二价阳离子螯合剂常用于破坏Alg-Ca2+交联——使活细胞提取可行。收集细胞的定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析证明在15天iPSC分化期间心脏转录因子阶段特异性上调。早期心脏标志（GATA4、NKX2.5、TBX5）在9天达峰，而晚期标志（MYH6和cTnT）在15天最大化。这些结果表明通过iPSC负载多孔微凝胶成功建立心肌细胞分化微单元。为后续心肌修复应用，研究用iPSC衍生心肌细胞（iPSC-CM）多孔微凝胶培养HPMP支架21天。iPSC-CM迁移在7天启动，伴随细胞从微凝胶渐进扩展。随后，大量iPSC-CM细胞聚集在HPMP互联孔网络内呈现密集功能分布21天时。这些结果证明HPMP促进心肌细胞迁移同时维持功能性，为心肌修复提供先进递送平台。
尽管HPMP与组织优异黏附性，此特性风险术后胸腔黏连可能进一步损伤脆弱心肌。为此，研究通过多材料生物打印微凝胶基生物墨水和甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）工程Janus黏附多级孔微凝胶基水凝胶贴片（JHPMP），呈现不对称黏附功能。为评估多层打印可行性，使用DLP打印制造具有明确多层结构的圆柱体。HPMP和HAMA的稳定分层连接成功观察。JHPMP也维持明显可逆压缩性，100次压缩循环后无显著结构断裂或变形。为评估细胞行为，研究采用JHPMP在多孔层包含H9C2负载微凝胶和无细胞HAMA。图示细胞在14天后优先迁移向连接处多孔结构侧。
由于微凝胶制造的有利细胞和机械性能，研究在大鼠MI模型通过左前降支冠状动脉结扎建立评估其治疗疗效。为评估心肌梗死修复疗效，首先通过超声心动图评估大鼠心脏功能28天内。显示MI和HPMP组左心室前壁发生 bare 收缩，iPSC-MC注射组观察较小收缩波，与假手术组相比。相反，MC-HPMP和MC-JHPMP组显示左心室前壁显著收缩活动。28天终点心脏功能通过分析典型超声心动图参数评估，包括射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）、收缩期左心室内径（LVIDs）和舒张期左心室内径（LVIDd）。其中，EF和FS在MC-HPMP和MC-JHPMP组较MI组显著增强，同时LVIDs和LVIDd显著减小，指示心脏功能改善。
研究在植入后28天重新开胸进一步评估JHPMP体内不对称黏附性能。大体形态显示HPMP和MC-HPMP组严重纵隔黏连，心脏组织融合至胸壁。相反，MC-JHPMP呈现牢固黏附至心尖心室基底部，无胸腔黏连，同时允许完全心脏抬升而不引起胸腔结构变形。此现象可能原因在于JHPMP不仅通过其优异物理屏障
