《Advanced Science》：Self-Assembled Myricetin-Arginine Conjugate Nanozymes for Targeted Suppression of Joint Inflammation and Osteoclastogenesis in Rheumatoid Arthritis
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本研究开发了一种无载体的杨梅素-精氨酸共轭纳米酶（MANZs），通过Mannich反应和自组装技术构建，能够通过阳离子氨基酸转运蛋白2（CAT2）特异性靶向M1巨噬细胞，在胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型中表现出优异的关节炎症靶向能力。MANZs通过清除活性氧（ROS）、重编程巨噬细胞极化（M1向M2转化）和抑制破骨细胞分化，实现多模式治疗效应，显著缓解关节肿胀和骨侵蚀，且无系统性毒性，为类风湿性关节炎（RA）治疗提供了具有高生物相容性和转化潜力的新型纳米平台。
2.1 杨梅素-精氨酸共轭纳米酶（MANZs）的合成与表征
MANZs通过Mannich反应将L-精氨酸（Arg）的亲水性氨基与杨梅素（Myr）的酚羟基进行共价连接，随后通过非共价相互作用（π-π堆积、氢键和静电作用）自组装成均匀的纳米结构。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）显示MANZs为球形颗粒，直径在100-200纳米之间，具有单分散性和光滑表面。能量色散X射线光谱（EDS）元素 mapping 证实纳米酶由碳（C）、氮（N）、氧（O）均匀组成。X射线衍射（XRD）和选区电子衍射（SAED）分析表明MANZs为无定形结构。动态光散射（DLS）测定其水合动力学直径约为306纳米，多分散指数（PDI）为0.20，在不同介质（去离子水、PBS、DMEM培养液）中均表现出良好的胶体稳定性，zeta电位分别为-30.8毫伏、-14.9毫伏和-8.08毫伏。
傅里叶变换红外光谱（FTIR）在1675 cm-1处显示出胍基的特征吸收峰，证实了精氨酸的成功引入。拉曼光谱在1367 cm-1和1574 cm-1处的峰分别对应于杨梅素的O-H振动和C=C伸缩振动，表明其芳香环结构得以保留。核磁共振氢谱（1H NMR）和碳谱（13C NMR）出现了新的特征峰，证明了新化学结构的形成。分子动力学模拟和径向分布函数（RDF）分析揭示了分子间存在强烈的短程有序作用，进一步佐证了自组装机制。
在抗氧化性能评估中，MANZs表现出类过氧化氢酶活性，能催化H22O2分解产生氧气。同时，MANZs能剂量依赖性地清除超氧阴离子、ABTS+自由基和DPPH自由基，在125微克/毫升浓度下对ABTS+和DPPH的清除率分别达到62.85%和63.32%，显示出强大的抗氧化能力。
2.2 MANZs的体外靶向性与抗氧化性能
细胞毒性实验表明MANZs在高达200微克/毫升浓度下对骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）活力无显著影响，具有良好的生物相容性。通过FITC标记的MANZs（MANZs-FITC）进行细胞摄取实验，激光共聚焦显微镜（CLSM）和流式细胞术结果显示，LPS/IFN-γ诱导的M1巨噬细胞在1小时内对MANZs的摄取率（26.1%）显著高于M0（19.3%）和IL-4诱导的M2巨噬细胞（17.7%），表明MANZs具有M1靶向性。
Western blot和免疫荧光染色证实，LPS/IFN-γ刺激能显著上调BMDMs中CAT2蛋白表达（1.5倍），而IL-4处理无此效应。使用siRNA敲低CAT2表达后，M1巨噬细胞对MANZs的特异性摄取被显著抑制，证明CAT2是MANZs靶向M1巨噬细胞的关键分子。
在ROS清除实验中，LPS刺激显著提高了BMDMs内DCF荧光强度（DCF阳性细胞比例从1.5%升至60.3%）。MANZs处理能最有效地逆转这一现象，将DCF阳性细胞比例降至21.5%，其效果优于单独使用Arg（51.6%）或Myr（26.2%），表明MANZs能有效缓解细胞内氧化应激。
2.3 MANZs重编程巨噬细胞向抗炎表型极化
形态学观察显示，LPS/IFN-γ刺激使BMDMs变为扁平多伪足形态（M1特征），而MANZs处理则诱导细胞变为梭形或长梭形（M2特征）。细胞骨架染色（Actin-Tracker Red-555）进一步证实了这种形态转变。
流式细胞术分析表面标志物显示，LPS/IFN-γ刺激使M1巨噬细胞（CD86+CD206-）比例从10.67%增至31.36%，M2巨噬细胞（CD206+CD86-）比例从27.87%降至13.6%。MANZs处理显著逆转了这一趋势，使CD86+比例降至24.77%，CD206+比例升至21.33%，效果与IL-4相当。
在基因表达水平，qRT-PCR结果显示MANZs能显著下调M1标志基因（CD86、iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达，同时上调M2标志基因（CD206、IL-10）。Western blot证实MANZs处理降低了CD86蛋白水平，提高了CD206蛋白水平。ELISA检测细胞因子分泌显示，MANZs减少了促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的释放，增加了抗炎因子（IL-10、TGF-β）的分泌。这些结果共同表明MANZs能有效促进巨噬细胞从M1向M2表型重编程。
2.4 MANZs保护BMSCs并抑制破骨细胞分化
通过Transwell共培养系统评估MANZs对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的保护作用。Calcein AM/PI染色和Annexin V-FITC/PI流式细胞术显示，LPS预处理的BMDMs对共培养的BMSCs具有明显细胞毒性，总凋亡率达20.8%。而经MANZs预处理的BMDMs则显著减轻了这种毒性作用，使BMSCs凋亡率降至4.48%。CCK-8实验表明MANZs能逆转M1巨噬细胞对BMSCs增殖的抑制作用。
在破骨细胞分化实验中，RANKL和M-CSF诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞（OC组），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色显示TRAP阳性区域达29.6%。MANZs处理显著抑制了破骨细胞分化，使TRAP阳性区域降至1.4%，效果优于等摩尔的Arg（6.8%）或Myr（19.8%）。DAPI/F-actin染色显示OC组多核破骨细胞面积占比达20%，而MANZs处理将其降至0.5%。qRT-PCR分析表明MANZs能显著下调破骨细胞相关基因（Ctsk、Itgb3、Nfatc1、RANK、TRAP）的表达。
2.5 MANZs抑制破骨细胞分化的机制研究
通过RNA测序（RNA-seq）分析MANZs对破骨细胞分化的转录组调控。主成分分析（PCA）显示不同处理组的样本明显分离，表明MANZs能调控破骨细胞诱导培养基引发的全局转录重编程。差异表达基因（DEGs）聚类分析发现，MANZs能特异性抑制破骨细胞分化相关基因的上调。
在OC组与OC+MANZs组的比较中，鉴定出466个显著差异表达基因，其中156个下调。蛋白互作网络（PPI）分析识别出15个下调的核心基因，包括Itgb3、Itgax、Mmp9、Mmp14、Ctsk等，均与破骨细胞分化相关。KEGG通路富集分析显示这些下调基因显著富集于破骨细胞分化、PI3K-Akt信号通路和TNF信号通路。Gene Ontology（GO）富集分析表明MANZs下调了与细胞粘附、迁移和炎症相关的生物学过程。基因集富集分析（GSEA）进一步证实MANZs抑制了破骨细胞分化（NES = -1.34）和TNF信号通路（NES = -1.26）的异常激活。这些结果表明MANZs通过调控PI3K-Akt和TNF通路，抑制下游转录因子Nfatc1及其靶基因（Itgb3、Mmp9、Ctsk等），从而抑制破骨细胞分化。
2.6 MANZs的体内生物安全性评价
溶血实验显示MANZs在高达500微克/毫升浓度下溶血率仅为0.72%，表现出良好的血液相容性。急性毒性实验确定MANZs对小鼠的急性致死剂量为289毫克/千克。通过尾静脉注射MANZs（10和20毫克/千克）后，主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色未发现明显毒性迹象。血液学和生化分析也未见异常。药代动力学研究表明Cy7标记的MANZs（MANZs-Cy7）的血浆半衰期约为15分钟。
2.7 MANZs在CIA小鼠模型中的体内治疗评价
在胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型中，体内荧光成像显示MANZs-Cy7在注射后30分钟即可特异性靶向并富集于发炎的关节部位，信号可持续8小时，而游离Cy7染料则迅速通过肾脏清除。治疗性实验显示，与RA模型组（关节炎评分11.88）相比，MANZs治疗（20毫克/千克）能显著缓解关节肿胀，将关节炎评分降至2.50，并改善RA相关的体重减轻。行为学疼痛评估表明MANZs能显著提高机械痛阈和热痛耐受时间，缓解痛觉过敏。
Micro-CT三维重建和矢状面图像显示MANZs治疗能显著减轻踝关节骨侵蚀。骨形态计量学参数分析表明，20毫克/千克MANZs治疗使骨小梁骨密度（Tb.BMD）从736.1毫克HA/立方厘米增至975.5毫克HA/立方厘米，骨体积分数（Tb.BV/TV）从0.85升至0.95，骨小梁分离度（Tb.Sp）从0.065毫米降至0.044毫米，有效保护了骨微结构。
踝关节组织qRT-PCR分析显示MANZs能下调破骨细胞相关基因（Ctsk、Nfatc1）和促炎细胞因子（IL-1β）表达，上调抗炎细胞因子（IL-10）表达。Western blot证实MANZs能逆转RA模型中CD86上调和CD206下调。组织化学染色（H&E、Masson、Safranin O/Fast Green）显示MANZs减轻了免疫细胞浸润和软骨基质降解。TRAP染色显示MANZs将TRAP阳性区域从0.6%降至0.07%，显著抑制了破骨细胞形成。
免疫荧光共定位分析发现，RA模型组踝关节中iNOS+CAT2+双阳性区域达1.42%，而MANZs治疗能剂量依赖性地将其降至0.07%（20毫克/千克组），表明MANZs能靶向并调节关节内M1巨噬细胞。CD86和CD206免疫荧光进一步证实MANZs能促进关节内巨噬细胞从M1向M2表型转化，缓解滑膜炎症。
3 结论
本研究成功构建了无载体自组装的杨梅素-精氨酸共轭纳米酶（MANZs），其能通过CAT2介导的机制特异性靶向关节炎症部位的M1巨噬细胞。MANZs通过清除ROS、重编程巨噬细胞极化和抑制破骨细胞分化，在CIA小鼠模型中表现出显著的治疗效果，能缓解关节肿胀、抑制骨破坏、减轻疼痛，且无系统性毒性。转录组分析揭示MANZs通过调控TNF和PI3K/Akt通路抑制破骨细胞生成。该研究为RA治疗提供了一种具有高生物相容性和临床转化潜力的新型纳米治疗策略。
4 实验部分（简要总结关键实验方法）
MANZs通过一锅法Mannich反应合成，使用L-精氨酸、杨梅素和甲醛为原料。细胞实验使用RAW264.7细胞系和原代培养的BMDMs、BMSCs。CIA模型通过两次免疫（完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂与II型胶原的乳化液）建立。体内治疗通过尾静脉注射MANZs（10和20毫克/千克）进行。评估指标包括关节炎评分、痛觉行为、micro-CT骨形态计量、组织化学染色、qRT-PCR、Western blot、流式细胞术和免疫荧光等。统计学分析使用单因素方差分析（ANOVA）或Student t检验，显著性水平设定为*p < 0.05, p < 0.01,*p < 0.001。
