《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Tumor Electric Field Therapy Inhibits TGF-β/C1R Signaling Axis-Driven Epithelial-Mesenchymal Transition in Glioblastoma
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本研究揭示了肿瘤电场疗法（TEFT）在胶质母细胞瘤（GBM）治疗中的新机制：通过抑制TGF-β/SMAD2/3/STAT3信号通路下调补体成分C1R的表达，进而逆转上皮-间质转化（EMT）过程。研究发现C1R在间质亚型（MES）GBM中高表达且与不良预后相关，TEFT干预可诱导肿瘤细胞从梭形向鹅卵石样形态转变，抑制迁移侵袭能力。该工作为TEFT的临床应用提供了分子理论基础，并提示C1R可作为GBM治疗的潜在生物标志物和联合治疗靶点。
ABSTRACT
胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性的原发性脑肿瘤，其中间质亚型（MES）预后极差。肿瘤电场疗法（TEFT）作为一种新兴的辅助治疗手段，其分子机制尚未完全阐明。本研究通过多组学分析发现补体成分C1R位于TEFT下调基因、预后不良相关基因和肿瘤功能状态基因的交集点，在MES亚型GBM中显著高表达且与EMT过程密切关联。
3.1 C1R与TEFT抗肿瘤效应及EMT过程相关
通过CancerSEA数据库分析GBM的14种功能状态，结合转录组测序发现TEFT处理（200 kHz，2.2 V/cm，72 h）可上调1594个基因、下调1664个基因。三重条件筛选（功能状态基因、不良预后基因、TEFT下调基因）唯一交集基因为C1R。单细胞RNA测序（GSE1311928数据集）显示C1R主要在MES样恶性细胞中高表达，且与HALLMARK EMT特征评分呈正相关。多组学泛癌分析证实C1R蛋白水平与EMT评分显著正相关（GBM中Rho=0.66，p=2.2e-16）。生存分析显示C1R高表达与CGGA-GBM（p=0.012）、Gravendeel-GBM（p=0.002）等数据集的不良预后相关。
3.2 C1R在MES样恶性细胞和间质亚型GBM中高表达
单细胞转录组分析将GBM细胞分为AC样恶性细胞、CD8+T细胞、MES样恶性细胞等亚群，C1R在MES样恶性细胞中表达最高。组织水平分析显示C1R表达随胶质瘤级别升高而增加，在GBM中达到峰值。跨9个独立队列（CGGA、TCGA等）验证C1R在MES亚型中显著高于原神经（PN）和经典（CL）亚型（p<0.05）。Ivy GAP数据库空间转录组显示C1R在肿瘤细胞区（CT）和坏死周边假栅栏细胞（PAN）中表达最高。反向蛋白芯片（RPPA）分析发现C1R高表达组中PAI-1、Caveolin-1等EMT相关蛋白上调。
3.3 TEFT下调C1R并抑制上皮-间质转化
TEFT处理后U87和U251细胞形态由梭形变为鹅卵石样，上皮标志物E-cadherin表达升高，间质标志物N-cadherin、Vimentin和YKL-40降低。通过siRNA/shRNA敲低C1R后，细胞出现类似形态变化，迁移和侵袭能力显著减弱（Transwell实验p<0.001）。转录组测序显示C1R敲低后EMT获得性标志物（CDH2、VIM、FN1等）下调，而EMT衰减标志物（CDH1、TJP1等）上调。
3.4 TGF-β/SMAD2/3/STAT3是C1R的上游调控通路
克隆形成实验和EdU增殖检测表明C1R敲低可抑制GBM细胞增殖（p<0.001）。多组学分析显示C1R蛋白水平与mRNA水平显著正相关（GBM中Rho=0.72），提示转录调控为主控机制。生物信息学预测（ChIP-Atlas等6个数据库）发现STAT3是C1R的唯一共同上游转录因子，JASPAR数据库鉴定出保守结合基序TTTTTGGAA。ChIP-qPCR验证STAT3直接结合C1R启动子（p<0.001）。Western blot显示TEFT处理后TGF-β、p-STAT3、p-SMAD2/3和C1R表达均下降，而STAT3/SMAD2/3总蛋白不变。小分子抑制剂WP1066（STAT3抑制剂）和NCB-0846（SMAD2/3抑制剂）处理均可降低C1R表达。
3.5 外源性TGF-β恢复C1R表达并逆转C1R敲低诱导的MET
在C1R敲低细胞中加入TGF-β（0-20 ng/mL，0-48 h），可剂量和时间依赖性地恢复C1R、p-STAT3和p-SMAD2/3表达。正常GBM细胞经TGF-β处理后出现间质形态转变，E-cadherin下调而N-cadherin、Vimentin上调。在C1R敲低细胞中外源TGF-β可逆转上皮样形态，重新激活间质标志物表达。
3.6 体内实验验证TEFT对TGF-β/C1R轴及EMT的抑制作用
临床样本免疫组化显示TEFT治疗后C1R表达降低。大鼠GBM模型中TEFT处理组TGF-β、p-SMAD2/3和p-STAT3表达显著下降（p<0.01）。NCG小鼠皮下移植瘤实验表明C1R敲低可抑制肿瘤生长（第21天肿瘤重量p<0.001）。免疫组化证实TEFT处理或C1R敲低后E-cadherin表达升高，N-cadherin和Vimentin降低。
4 Discussion
本研究首次揭示TEFT通过TGF-β/SMAD2/3/STAT3/C1R轴抑制EMT的分子机制。C1R作为MES亚型GBM的关键分子，其表达受STAT3转录调控，并与肿瘤微环境评分正相关。针对TEFT抵抗性MES亚型GBM，联合靶向TGF-β/C1R轴可能增强疗效。研究局限性包括肿瘤异质性影响、缺乏原位模型验证等，需进一步探索C1R下游效应机制。
5 Conclusion
TEFT通过抑制TGF-β/SMAD2/3/STAT3/C1R信号轴逆转EMT过程，C1R可作为GBM预后生物标志物和联合治疗靶点，为克服间质亚型治疗抵抗提供新策略。
