《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Lineage-Biased Neural Stem Cell Grafting Promotes Neuronal Differentiation and Vascular Repair in the Chronic Phase of Stroke
1 引言
缺血性卒中（Ischemic Stroke, IS）是一种严重的脑血管疾病，约占所有卒中病例的85%，其导致广泛的神经元和血管内皮细胞死亡，破坏神经回路，并损害血脑屏障完整性。在脑缺血过程中，氧气和营养物质输送的缺乏导致活性氧积累，进而引发神经元死亡、血脑屏障破坏和神经炎症。随着病情进入慢性期，持续的神经炎症和胶质瘢痕形成阻碍了神经元再生和神经回路重建，最终使运动功能恢复更加困难。
神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）移植是一种有前景的治疗策略。NSCs能够分化为神经元并释放神经营养因子，促进半暗带区域的神经修复并改善整体功能恢复。研究表明，NSCs移植可促进卒中小鼠的运动功能恢复，减轻卒中后神经炎症，并刺激内源性NSCs的增殖。此外，NSCs移植还能在缺血/再灌注损伤后促进大鼠脑内的血管生成，这一效应与血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）表达增强和微血管密度增加相关。
然而，NSCs的临床应用面临挑战。首先，NSCs来源的异质性和谱系特异性分化倾向导致移植后结果不一致。其次，精确控制移植NSCs的命运仍然困难。尽管NSCs可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，但病理微环境会使其分化偏向星形胶质细胞谱系，导致胶质瘢痕形成，最终阻碍功能恢复。由于IS同时影响神经和血管成分，治疗策略应侧重于神经元保护和血管完整性及功能的恢复。血管修复对于重新建立脑血流（Cerebral Blood Flow, CBF）、维持血脑屏障完整性以及重建支持神经元存活和再生的微环境至关重要。本研究旨在评估非胚胎体（non-Embryoid Body, nEB）来源的NSCs是否能促进IS后的血管功能恢复，为干细胞疗法提供可靠的转化策略。
2 材料与方法
2.1 通过胚胎体（EB）形成进行hESCs分化
使用从中国科学院动物研究所获得的人胚胎干细胞（human Embryonic Stem Cells, hESCs；Q-CTS-hESC-2细胞系Q2）进行分化。细胞消化后形成胚胎体（Embryoid Bodies, EBs），并将其转移到低吸附培养皿中，在神经诱导培养基（Neural Induction Medium, NIM）中培养。从第4天起，EBs被转移到预包被重组人玻连蛋白（recombinant human Vitronectin, rhVTN）的六孔板中，并维持培养至第9天。从第9天到第10天，培养基更换为神经保存培养基（Neural Preservation Medium, NPM）。第11天，在NPM中添加碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor, bFGF）。
2.2 通过非胚胎体（nEB）方法进行hESCs分化
hESCs使用Accutase消化并重悬于E8培养基中。以1.5 × 105个细胞/cm2的密度接种，以确保最佳的贴壁和生长条件。通过将E8培养基更换为补充有2 mM GlutaMAX、500 nM LDN193189和10 μM SB431542的改良NIM（基于E6培养基）来启动分化。从第1天到第12天，细胞在相同的NIM中维持培养，每日更换培养基。分化12天后，评估细胞的神经谱系特异性。
2.3 血管内皮细胞的分化与管腔形成
将hESCs（mCherry-H9细胞系）消化成单细胞悬液并接种到预包被1%明胶的新培养板上。添加内皮分化培养基并培养6天。分化后，使用流式细胞术富集PE阳性内皮细胞（Endothelial Cells, ECs）群体，并接种到新培养板中进行进一步扩增和实验。
2.3.1 内皮细胞管腔形成实验
96孔板包被无生长因子基质胶（GFR-Matrigel）并使其凝固。然后，每孔接种50,000个ECs，每组设三个复孔。在8至16小时后捕获图像。设立两组：（1）空白组：仅EC培养基；（2）nEB-NSCs组：nEB-NSCs过夜培养基与EC培养基按1:1比例混合。
2.4 流式细胞术与荧光激活细胞分选
将细胞消化成单细胞悬液并使用Cytofix/Cytoperm溶液固定。为评估神经标志物表达，细胞在室温下用PAX6和SOX2抗体染色30分钟。染色后，加入DPBS，样品以1200 rpm离心3分钟。弃去上清液，将细胞重悬于300 μL DPBS中。使用BD Fortessa流式细胞仪进行分析，并使用FlowJo软件进行定量。使用BD FACS Fusion细胞分选仪分选mCherry阳性血管ECs。
2.5 定量实时PCR（RT-PCR）
使用TRIzol通用试剂从IS诱导的小鼠脑组织核心区域或贴壁培养的细胞中提取总RNA。按照Hifair II第一链cDNA合成超预混液（用于qPCR）提供的方案将RNA反转录为cDNA。使用Hieff QPCR SYBR Green Master Mix作为检测染料进行RT-PCR。所有测量均进行三次重复，mRNA水平归一化至Gapdh表达。
2.6 实验动物与伦理声明
使用8-10周龄的雄性C57BL/6小鼠。所有动物饲养在受控环境中，保持12小时光暗周期，自由获取水和食物。所有动物实验均经中国科学院动物研究所动物护理委员会批准（批准号：IOZ-IACUC-2021-105），并按照伦理指南进行。尽力减少动物痛苦并减少使用动物数量。
2.7 短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型
小鼠用三溴乙醇（Avertin；腹腔注射，400 mg/kg）麻醉并固定于手术平台。暴露颈总动脉，仔细分离颈外动脉和颈内动脉。结扎颈外动脉远端，近端切开并做切口。将硅胶涂层的单丝线插入颈内动脉并推进至大脑中动脉（Middle Cerebral Artery, MCA）以诱导缺血。60分钟后，缓慢撤出单丝线以恢复血流。选择在tMCAO期间经激光散斑成像证实颞叶脑血流减少超过70%的小鼠进行后续研究。tMCAO主要损伤运动相关区域，包括大脑皮层和纹状体。梗死体积在3个月内持续演变。
2.8 细胞移植
动物随机分为对照组和干预组，后者在tMCAO手术后14天（此时脑内炎症细胞已大量减少）接受神经干细胞移植。细胞移植在两个部位进行——一个在皮层，一个在纹状体，均靠近梗死区，使用以下坐标：前囟后（Anterior-Posterior, AP）：+0.1 mm，中线旁（Medial-Lateral, ML）：+1.5 mm，背腹侧（Dorsal-Ventral, DV）：-4.5 mm（纹状体）；AP：-1.0 mm，ML：+1.5 mm，DV：-1.5 mm（皮层）。
将nEB-NSCs消化成单细胞悬液，在移植前置于冰上保存。每个注射部位注射1 μL细胞悬液（1 × 105个细胞），而对照动物注射1 μL无菌盐水。每只小鼠在tMCAO手术后2周接受单次移植。每个结果指标的处死时间点如图所示。
2.9 免疫荧光
小鼠经心灌注并在4%多聚甲醛中后固定24小时，然后在30%蔗糖溶液中脱水72小时，再进行冰冻切片。冰冻切片用含0.5% Triton X-100的DPBS洗涤。一抗和二抗在室温下孵育2小时，脑切片使用含DAPI的封片剂封片。从每只小鼠收集连续脑切片，以捕获所有包含移植细胞的区域。该系列覆盖梗死和移植物的头尾范围，每组至少有两个这样的切片。在相同放大倍数下采集图像并在相同设置下处理，按面积量化细胞数量。贴壁细胞使用4%多聚甲醛固定30分钟，然后用DPBS洗涤三次，再进行封闭和免疫荧光处理。使用Zeiss LSM880 Fast Airyscan共聚焦显微镜捕获图像，并使用ImageJ和ZEAN软件进行图像分析。
2.10 行为学测试
在nEB-NSCs移植后的0、1、2、3、4和6个月进行旷场实验（Open Field Test, OFT）和圆筒实验。所有测试均由对实验条件不知情的实验者在隔音的行为测试室中进行，室内光强、温度和湿度受控。
在OFT中，将小鼠轻轻放置在旷场箱中央，记录10分钟内的总移动距离和速度。在圆筒实验中，将小鼠置于透明圆筒中，记录其活动10分钟。记录每只小鼠前爪接触圆筒壁（左、右或双侧）的情况，并计算受伤侧（右侧）使用的比例。
2.11 磁共振成像（MRI）
使用11.7 T MRI扫描仪获取T2加权图像（T2-Weighted Images, T2WI）。在nEB-NSCs移植前和移植后6个月进行活体扫描。步骤如下：小鼠用1.5%异氟烷麻醉并定位在MRI扫描仪中，然后在整个过程中用1%异氟烷维持麻醉。T2WI扫描参数设置如下：视野（Field of View, FOV）= 20 × 16 mm，重复时间（Repetition Time, TR）/回波时间（Echo Time, TE）= 2800/30 ms，采集矩阵= 256 × 205，29个切片，切片厚度0.5 mm，两个平均值，快速采集弛豫增强因子= 8。
2.12 RNA测序
分离每只小鼠的左脑皮层、纹状体和海马体，在液氮中速冻2分钟，随后送往华大基因（中国深圳）进行RNA测序。根据华大基因的方案提取总RNA，并使用片段分析仪评估RNA质量。
2.13 统计分析
使用GraphPad Prism 9.0进行统计分析。两组比较采用双尾Student's t检验，多组比较采用Tukey多重比较检验和单因素方差分析。所有数据均报告为平均值±标准误。p值 < 0.05被认为具有统计学意义。使用Shapiro-Wilk检验检查数据正态性，对于小样本量组，还通过检查Q-Q图评估正态性。所有数据集均呈正态分布。
3 结果
3.1 nEB-NSCs的分化与表征
评估了两种获得可移植NSCs的策略：一种利用胚胎体（EB）形成，另一种采用不经过EB形成的直接分化方案（非EB）。两种策略都通过加入SMAD和TGF-β信号通路抑制剂（分别为LDN193189和SB431542）来模拟胚胎发育线索。通过非EB分化方案获得的NSCs被命名为nEB-NSCs。
在分化过程中，细胞以单层形式贴附于培养表面，形态均匀，细胞间隙小而均匀。免疫荧光染色证实了NSCs标志物PAX6、SOX1、SOX2和NESTIN的表达。为满足移植标准，建立了标准化的质量控制流程。流式细胞术结果进一步验证了PAX6、SOX2、NESTIN和CD133的高表达，支持其NSCs身份。在神经元诱导后，nEB-NSCs分化为TUJ1阳性神经元，未检测到GFAP阳性星形胶质细胞分化。
作为比较，也通过EB阶段（EB-NSCs）使用另一种分化系统获得了NSCs。与nEB-NSCs方案类似，该方法采用了针对SMAD和TGF-β信号通路的抑制剂。将细胞消化成团块形成EBs，从第4天到第9天在贴壁条件下培养以诱导玫瑰花结形成，然后在第11天再次消化并收集用于表征和后续移植。所得的EB-NSCs表达了关键的NSCs标志物，包括SOX1、PAX6、SOX2和NESTIN，证实了其NSCs身份。
3.2 nEB-NSCs在体外表现出增强的神经元命运倾向和功能潜能
对两种分化系统来源的NSCs进行了转录组测序，结果证实EB-NSCs和nEB-NSCs均来源于ESCs。与EB-NSCs相比，nEB-NSCs显示出显著更高的NSC相关基因表达，包括PAX6、SOX2、VIM、TNC、SOX21、SOX11和NES。相反，少突胶质细胞标志物（OLIG1、OLIG2、SOX10）和星形胶质细胞标志物（SOX9、ALDOC、ATP1A2、SERPING1、AMIGO2）的表达显著降低。这些结果表明nEB-NSCs更倾向于神经元谱系，而胶质谱系分化能力减弱。
重要的是，nEB-NSCs上调了多个与血管生成相关的基因，包括CLDN5、CDH5、SOX7、EDH4、CEACAM1和PECAM1。差异基因分析显示，nEB-NSCs在血管再生、神经发生、神经干细胞增殖、神经元投射引导和神经元突触形成等相关通路中显著富集。这些发现表明nEB-NSCs在促进血管和神经再生方面具有增强的能力。
为了研究两种分化系统之间的差异，分析了关键谱系标志物的表达，包括PAX6、OLIG2和SOX10。与EB-NSCs相比，nEB-NSCs表现出显著更高的PAX6表达和更低的SOX10表达。为了探究这些差异的原因，考虑了纯化过程。值得注意的是，在玫瑰花结形成后，EB-NSCs需要传代富集以达到超过90%的纯度以满足移植标准。相比之下，nEB-NSCs不需要传代，分化12天后即可用于移植。基于此，假设传代过程可能是观察到的差异的主要因素。因此，将两种类型的NSCs传代多达五次，并在不同代次收集细胞进行基因表达分析。在这种五次传代方案下，胶质细胞转录因子（包括OLIG2、SOX10和GLAST）的表达显著增加。同时，PAX6和SOX2阳性的nEB-NSCs和EB-NSCs的比例到第5代（P5）时下降。
此外，与未传代的nEB-NSCs（nEB-NSCs-P0）相比，传代的EB-NSCs（EB-NSCs-P5）表现出神经元标志物（如PAX6和SOX1）表达减少，同时少突胶质细胞标志物SOX10表达增加。OLIG2和GLAST的表达水平保持相对稳定。类似地，在nEB-NSCs中，传代至P5导致OLIG2、SOX10和GLAST的表达相较于P0细胞显著上调。这些发现表明，重复传代下调了神经元标志物表达，同时增强了胶质谱系标志物表达，从而将NSCs的分化倾向转向胶质命运。基于这些结果，建议在分化过程中尽量减少传代，以更好地保留NSCs的神经元特性。
除了评估传代效应外，两种NSCs类型在不同的培养条件下培养。为评估培养系统的影响，检测了在不形成EB的情况下，使用补充N2和B27的培养基直接将ESCs分化的方案。在分化12天后评估分化效率。流式细胞术分析显示，PAX6和SOX2阳性细胞的比例较低，并且显著低于EB-NSCs和nEB-NSCs。
3.3 移植的nEB-NSCs在缺血脑中呈现神经元命运
为了评估nEB-NSCs在体内的分化能力，将其移植到经受IS的小鼠脑中，细胞注射在tMCAO手术后14天进行。移植后六个月，在梗死区发现了人核（HuNu）阳性的移植细胞，而在注射盐水（对照）小鼠的梗死组织中则没有。移植后一个月，梗死区周围的大多数STEM121阳性移植物表现出神经元标志物TUJ1的表达。在这个时间点，梗死区周围仍有一些STEM121阳性移植物表达PAX6，表明在此阶段仍存在NSCs。到移植后三个月和六个月，STEM121阳性移植物表达成熟神经元标志物NeuN，表明它们分化为成熟神经元，其中在6个月时，96.9% ± 1.6%的STEM121阳性移植物共表达NeuN。此外，观察到一些NeuN+STEM121?的宿主神经元。这些发现表明nEB-NSCs在病理环境中主要分化为神经元。未检测到共表达Oligo2/STEM121的细胞，表明nEB-NSCs未采用少突胶质细胞命运。而且，只有一小部分STEM121阳性细胞共表达GFAP，占3% ± 0.35%，反映了有限的星形胶质细胞分化倾向。
相比之下，移植后，EB-NSCs表达了神经元标志物TUJ1和星形胶质细胞标志物GFAP，表明一部分移植细胞已分化为星形胶质细胞，占8% ± 0.87%。这些发现表明，与EB-NSCs相比，nEB-NSCs表现出更强的神经元谱系倾向。
3.4 移植的nEB-NSCs表现出区域特异性的神经元身份
鉴于谷氨酸能神经元是皮层中主要的兴奋性神经元亚型，首先评估了移植后6个月向该谱系的分化。位于梗死皮层区域附近的STEM121阳性移植细胞共表达了囊泡谷氨酸转运体vGlut1，将其鉴定为谷氨酸能神经元。定量分析显示，70.33% ± 2.72%的移植细胞同时为STEM121和vGlut1阳性。相比之下，在纹状体中未检测到vGlut1阳性的移植细胞。鉴于运动皮层中存在胆碱能神经元，评估了胆碱能分化。一部分存活的移植细胞表达了胆碱乙酰转移酶（Choline Acetyltransferase, ChAT），表明分化为胆碱能神经元，其中29.67% ± 3.22%的STEM121阳性细胞共表达ChAT。
纹状体主要由GABA能中型多棘神经元组成，约占纹状体神经元的95%，其余5%为无棘中间神经元。为了确定纹状体中的移植细胞是否采用了GABA能身份，评估了GABA表达。定量显示65.00% ± 6.08%的STEM121阳性细胞共表达GABA，表明成功分化为GABA能神经元，并可能有助于基底神经节回路修复。然而，只有2.00% ± 0.57%的STEM121阳性细胞表达DARPP32，表明只有一小部分移植细胞分化为纹状体投射神经元。
3.5 nEB-NSCs移植促进神经元再生和血管发育
为了评估缺血脑中的神经元修复，在移植后1个月和6个月对梗死半球脑组织进行了转录组分析。移植后一个月，与盐水组相比，nEB-NSCs组上调的基因主要富集在与神经发生正调控、神经投射发育、神经祖细胞分化以及抑制神经元凋亡相关的通路中。相反，下调的基因主要与神经递质受体活性和神经递质运输相关。先前的研究已确定由过度神经递质释放引起的兴奋性毒性是IS的关键病理机制。我们的发现表明nEB-NSCs移植可能减轻神经递质诱导的兴奋性毒性，突出了其在IS治疗中的潜力。
移植后六个月，与盐水组相比，nEB-NSCs组上调的基因在与中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）发育和神经元再生相关的通路中显著富集。这些包括端脑前脑发育、神经元分化、神经元命运特化、CNS神经元分化和轴突引导。这种富集模式突出了nEB-NSCs移植在促进CNS修复和神经元再生中的关键作用。此外，基因网络分析显示，广泛的发育相关通路共享共同的基因，表明这些过程之间存在协调的调控关系和潜在的串扰。
IS由动脉突然阻塞引起，导致影响神经元和ECs的缺血和缺氧。NSCs在血管修复中的作用尚不清楚；因此，研究了NSCs移植是否促进缺血损伤后的血管恢复。移植后一个月，几个血管相关基因，包括Cdh1、Cdh5和Pecam1，在nEB-NSCs组中显著上调，表明血管发育增强。GO富集分析进一步表明与血管发育、血管重塑、血管生成和VEGF产生密切相关。此外，GSEA表明在nEB-NSCs移植后，VEGF产生和血管发育的调控存在显著正相关。
移植后六个月，GO分析揭示了参与血液循环、血压调节和血管内皮细胞迁移的基因持续上调。GSEA还显示nEB-NSCs组中血压调节通路显著正富集。总之，这些结果表明血管重建在移植后早期启动并持续较长时间，有助于长期血管恢复。
3.6 nEB-NSCs移植促进血管功能恢复
由于血管恢复是一个漫长而动态的过程，功能改善往往滞后于转录变化。因此，在移植后6个月评估了血管完整性和功能。在nEB-NSCs组中，激光散斑对比成像显示左MCA区域的CBF显著高于盐水组。此外，缺血半球的总CBF显著增加。另外，RT-PCR分析显示，在血管生成中具有重要作用的两个基因VEGFA和APOLD1在nEB-NSCs组中显著上调。皮层血管密度的量化进一步证明，nEB-NSCs组的血管长度和血管面积均显著增加。而且，体外管腔形成实验证明nEB-NSCs增强了ECs形成血管结构的能力。定量显示，与对照组相比，nEB-NSCs组的血管分支、血管密度和总血管面积显著增加。
整合转录组谱和CBF测量结果，观察到nEB-NSCs组的
