《Nature Chemical Biology》：Photo-cross-linking-assisted deorphanization deciphers GPR50–L-LEN pairing in metabolism
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本文开发了一种光交联辅助的G蛋白偶联受体（GPCR）去孤儿化平台，通过位点特异性掺入光交联剂DiZPK，实现了从天然生物样本中高效捕获GPCR配体。该研究成功将神经肽Little-LEN（L-LEN）鉴定为GPR50的内源性配体，并系统揭示了其通过Gαi信号通路调控能量代谢和体温稳态的分子机制，为代谢性疾病治疗提供了新靶点。
光交联稳定配体-GPCR相互作用
研究团队通过理性设计，将二嗪基光交联剂DiZPK位点特异性掺入GPCR的配体结合口袋附近。以已知受体-配体对神经肽Y（NPY）和NPY1R为模型，证实DiZPK的掺入不影响受体功能，且在紫外光照射下能有效稳定配体-受体相互作用。竞争实验显示，NPY1R拮抗剂BMS193885可阻断交联反应，证明了相互作用的特异性。
跨界面选择性捕获技术验证
通过将DiZPK分别引入配体结合阳性位点和阴性位点，研究发现只有阳性位点能有效捕获NPY，证明了平台的界面选择性。该系统成功应用于多种GPCR类型，包括单胺受体5-HT2A（捕获血清素）和脂质受体S1PR1（捕获鞘氨醇-1-磷酸），展示了其对不同化学性质配体的广泛适用性。
平台鉴定L-LEN为GPR50内源性配体
聚焦代谢相关孤儿受体GPR50，研究通过AlphaFold结构预测确定潜在结合位点，利用DiZPK平台从小鼠脑肽提取物中筛选候选配体。结合互补的蛋白质组学和交联肽组学分析，发现神经肽L-LEN是GPR50的高亲和力配体。通过可切割交联剂DiZASeC进一步验证了L-LEN与GPR50的直接物理相互作用，质谱分析揭示了其结合界面特征。
L-LEN特异性激活GPR50介导的Gi信号通路
结合实验显示，FITC标记的L-LEN能与GPR50特异性结合，纳米BRET实验证实其结合亲和力为纳摩尔级别。功能研究表明，L-LEN通过GPR50激活Gαi信号通路，抑制forskolin诱导的cAMP升高（EC50= 47.9 ± 0.12 nM），该效应可被百日咳毒素阻断。结构-功能分析发现L-LEN的C末端对其活性至关重要，而GPR50的跨膜区残基N185、T191等构成关键结合口袋。
体内外功能验证揭示代谢调控新机制
在原代神经元中，L-LEN通过激活GIRK通道抑制GPR50阳性神经元的自发放电。在体实验表明，GPR50主要表达于下丘脑背内侧部（DMH）GABA能神经元和脑室膜细胞。脑室注射L-LEN可激活GPR50阳性细胞，并抑制DMH神经元活动。值得注意的是，L-LEN水平与机体代谢状态正相关，空腹时下降，而摄食或 leptin 处理后升高。
基因敲除模型证实生理功能
Gpr50敲除和L-LEN敲除小鼠均表现出甲状腺激素水平降低和空腹诱导的蛰伏倾向增加。在空腹模型中，L-LEN注射能显著提高野生型小鼠的耗氧量和产热，该效应在Gpr50敲除鼠中消失。机制上，L-LEN-GPR50信号通过下丘脑-垂体-甲状腺轴和交感神经系统调节棕色脂肪组织UCP1表达和去甲肾上腺素水平，实现大脑-外周对话代谢调控。
研究意义与展望
该研究建立的光交联辅助去孤儿化平台为GPCR配体鉴定提供了通用策略。GPR50-L-LEN配对的确立不仅揭示了代谢稳态调控的新通路，也为肥胖、糖尿病等代谢性疾病的治疗提供了潜在靶点。该平台可扩展至其他孤儿受体研究，有望推动GPCR领域的新药研发。
