H9N2禽流感病毒（AIV）与APEC病毒在产蛋鸡中的协同致病性，关键在于巨噬细胞介导的过度炎症反应，这一过程通过MAPK/NF-κB信号通路实现

《Veterinary Microbiology》：Synergistic virulence of H9N2 AIV and APEC co-infection in laying hens involves a critical role for macrophage-mediated hyper-inflammation via the MAPK/NF-κB axis

DNA甲基化靶向治疗显著抑制了绵羊肺腺癌（OPA）模型中的JSRV病毒逆转录酶启动子（LTR）转录活性，dCas9-DNMT3A和dCas9-KRAB系统在U3区域关键CpG位点的甲基化诱导使肿瘤体积减少42.4%，小鼠生存期延长（HR=0.34-0.41），Env蛋白表达下降70.5%以上。表观遗传调控通过改变组蛋白修饰（H3K9me3↑/H3K4me3↓）和抑制转录因子结合，有效阻断Wnt信号通路。该研究为逆转录病毒相关癌症的精准治疗提供了新策略，并验证了AAV递送系统的可行性和成本优势。

　　

杜晓月|刘书英

内蒙古农业大学兽医学院，中国呼和浩特010018

摘要

羊肺腺癌（OPA）是一种由jaagsiekte羊逆转录病毒（JSRV）引起的传染性肿瘤疾病，由于缺乏有效的治疗方法，导致了显著的经济损失。基于发现健康组织中的内源性JSRV LTR高度甲基化，而OPA肺组织中的外源性JSRV LTR则去甲基化，本研究探讨了靶向DNA甲基化作为一种表观遗传治疗策略。我们构建了dCas9-DNMT3A和dCas9-KRAB表观基因组编辑系统，针对外源性JSRV LTR的U3区域中的关键CpG热点，并建立了小鼠肺部的exJSRV-LTR驱动的Env过表达肿瘤模型。结果显示，表观基因组编辑疗法使肿瘤负担显著减少了42.4%（P < 0.001），通过Kaplan-Meier分析和Cox比例风险模型确定生存期延长（风险比0.34–0.41，P < 0.005），同时Env蛋白表达降低了72.4%（免疫组化）和70.5%（Western blot定量）。安全性评估表明，处理过的小鼠在组织学、生化参数或炎症反应方面没有异常变化。机制研究证实，靶向甲基化显著降低了U3区域的转录因子占据。这是通过招募异染色质标记实现的，包括上调的H3K9me3和H3K27me3，以及下调的H3K4me3，以及甲基化读取蛋白。这些表观遗传变化共同抑制了LTR的转录活性。转化应用分析表明，基于AAV载体的肺部递送系统具有很好的可行性，治疗成本远低于传统的扑杀策略。LTR甲基化检测可以作为早期诊断生物标志物和育种选择工具。本研究为OPA的预防和控制提供了创新策略，推动了兽医精准医学的发展，并为其他逆转录病毒疾病提供了重要参考。

引言

羊肺腺癌（OPA）是一种由jaagsiekte羊逆转录病毒（JSRV）引起的传染性肺部肿瘤（De las Heras等人，2021年），由于缺乏有效的疫苗和治疗药物，给全球绵羊产业带来了持续的经济负担。最近的分析表明，外源性JSRV具有独特的病毒颗粒包装特性（Zhang等人，2025年）。流行病学调查显示，该疾病的感染率很高，突显了这一兽医问题的全球分布（Karakurt等人，2023年）。

JSRV的致癌特性主要归因于包膜蛋白（Env），它是感染细胞中的主要转化因子（Cousens等人，2024年）。机制研究揭示，JSRV介导的细胞转化涉及特定的蛋白质-蛋白质相互作用，特别是与细胞蛋白RALBP1的结合（Hull等人，2012年）。在小鼠模型中，JSRV包膜蛋白诱导的肺癌具有与Wnt信号通路激活密切相关的肿瘤发生性（Dolci等人，2020年）。这些通路对于维持转化细胞表型至关重要，是Env表达的下游效应器。由于Env的转录由LTR启动子驱动，因此通过DNA甲基化对LTR进行表观遗传沉默可能有效地从源头破坏这些致癌级联反应，为将LTR甲基化状态作为治疗干预点提供了依据。

DNA甲基化在逆转录病毒长末端重复序列（LTR）的转录控制中起着关键作用（Durnaoglu等人，2021年）。内源性逆转录病毒作为基因表达调节器，其异常激活与多种疾病密切相关（Zhang等人，2022年）。它们的表观遗传调控模式为治疗干预提供了新的可能性（Pflueger等人，2018年）。LTR启动子内的CpG位点的DNA甲基化创造了抑制性染色质环境，这对于控制逆转录病毒表达至关重要（Chen等人，2025年），这对各种病理学的治疗靶向具有重要意义（Simula等人，2025年）。

基于CRISPR的表观基因组编辑的最新进展提供了精确转录控制的强大工具。模块化的dCas9-SunTag DNMT3A系统克服了广泛的脱靶活性问题（Alerasool等人，2020年）。高效的KRAB结构域使得CRISPR干扰应用更加稳健（Nu?ez等人，2021年）。这些系统可以实现全基因组可编程的转录记忆（Seem等人，2024年），彻底改变了精准医学的发展（Saunderson等人，2023年）。

CRISPR/dCas9 DNA甲基化编辑在人类造血过程中是可遗传的，并可以塑造免疫细胞的命运（Park等人，2022年）。内源性逆转录病毒的新发DNA甲基化由KRAB-ZFPs/KAP1和ESET调控（Ecco等人，2016年）。最近的进展通过类病毒颗粒平台进一步提高了递送效率（Xu等人，2025年），新兴的临床应用展示了其转化潜力（Yuan等人，2025年）。已经建立了可遗传基因沉默的详细方法（Pattali等人，2025年）。

然而，仍存在几个关键的知识空白。LTR U3区域内负责转录控制的确切CpG位点尚未被绘制出来。此外，这些位点上的位点特异性甲基化与转录因子结合之间的因果关系尚不清楚。此外，是否可以通过靶向诱导DNA甲基化在体内治疗性地沉默外源性JSRV LTR也尚未得到验证。为了解决这些空白，本研究假设U3区域内关键CpG位点的甲基化状态通过影响转录因子占据和重塑染色质修饰，充当LTR转录活性的分子开关。我们构建了dCas9-DNMT3A和dCas9-KRAB表观基因组编辑系统，在小鼠肺部的exJSRV-LTR Env模型中验证了靶向甲基化对肿瘤发生的抑制作用，并阐明了其背后的分子机制。

研究设计、实验材料和伦理

本研究采用了双主线实验设计，包括目标-因果链验证和体内转化验证模块，整体实验流程如图1所示。动物实验采用了随机分组和双盲设计，主要终点已预先注册。样本大小是根据预期的肿瘤负担差异和风险比进行功率分析确定的。

实验材料包括健康的羊肺组织和OPA病理组织

OPA组织中的甲基化异常和LTR转录调控基础

为了建立研究的病理基础，本研究首先分析了健康羊组织和OPA病变组织之间JSRV LTR甲基化模式的差异。通过全基因组LTR序列比对和CpG密度分析，本研究确定了U3区域内5个与转录因子结合基序（如GCM1、ELF5、SP1和TEAD4）高度重叠的关键CpG位点，如图2A所示。

亚硫酸盐测序结果显示，平均甲基化水平

主要发现和理论贡献

本研究在三个层面上确立了“DNA甲基化作为exJSRV LTR的分子开关”的核心理论：位点、染色质和表型，并通过体内抑制实验验证了其转化可行性。CRISPR工具包的不断发展为表观遗传调控提供了前所未有的精度（Adli，2018年）。表观基因组编辑的理论框架正在迅速发展，但仍有许多未解决的问题（Rots和Jeltsch，2018年）。创新在于

结论

本研究通过体内证据表明，靶向增强U3区域甲基化和异染色质沉默可以显著抑制exJSRV LTR和Env驱动的肺腺癌表型，证实DNA甲基化可以作为OPA干预的有效分子开关。来自小鼠exJSRV-LTR Env肺肿瘤模型的实验结果表明，dCas9-DNMT3A和dCas9-KRAB表观基因组编辑系统均取得了显著的治疗效果。

CRediT作者贡献声明

刘书英：撰写——审稿与编辑、验证、资源管理、项目协调、方法学、资金获取、正式分析、概念化。杜晓月：撰写——初稿撰写、数据可视化、软件使用、方法学研究、数据整理。

机构审查委员会声明

所有动物实验均遵循内蒙古农业大学的动物实验指南，并获得了相应伦理委员会的批准（批准编号：2020007）。

知情同意声明

不适用。

资助

本研究得到了内蒙古重大科技专项计划（编号：2021ZD0010）、内蒙古教育厅创新团队项目（编号：NMGIRT2412）、内蒙古教育厅大学创新团队建设项目（编号：BR22–13–08）、内蒙古教育厅创新团队项目（编号：NMGIRT2412）、内蒙古草原人才创新团队项目（编号：20151031）以及相关研究专项的支持

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。