《Nature Communications》：Sulfur-containing class of broad-spectrum antivirals improves influenza virus vaccine development
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本研究针对传统灭活疫苗因病毒糖蛋白抗原损伤导致免疫原性不足的问题，开发了一类新型含硫小分子化合物(XM系列)。研究人员发现XM-01通过改变病毒膜脂质组成、增强膜有序性并提高相变温度，有效抑制膜融合过程而不影响糖蛋白构象。利用该特性制备的XM-01灭活流感疫苗(XM-01-IIV)在小鼠模型中诱导产生更高水平的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)中和抗体，其保护效果达到活病毒疫苗水平。该研究为开发高效灭活疫苗提供了新策略。
当全球卫生系统仍在应对COVID-19大流行的余波时，科学家们早已将目光投向未来可能引发疫情的病原体。世界卫生组织公布的优先研究名单清一色都是囊膜病毒，包括埃博拉、SARS-CoV-2和尼帕病毒等。这些病毒每年导致数百万人死亡，造成数万亿美元的经济损失。虽然现有疫苗能够降低病毒爆发带来的人员和经济损失，但针对新发病原体的疫苗候选物并不总能提供足够的疾病保护。因此，快速开发有效疫苗的能力变得至关重要。
全病毒灭活疫苗(WIV)相较于减毒活疫苗(LAV)具有重要优势，包括复制不完全性带来的更高安全性，以及相较于亚单位或基因疫苗能呈现更广泛的抗原谱。然而，WIV疫苗常常面临免疫原性不足或偶尔出现疫苗增强疾病的问题。这些问题通常源于灭活过程中病毒抗原的构象变化，这些过程通常涉及化学（如福尔马林或β-丙内酯）或物理（如加热、紫外线、辐照）方法。因此，开发能够完全灭活病毒同时保留糖蛋白天然免疫原性构象的方法至关重要。
以流感病毒(IV)为例，它每年导致多达10亿感染和35-65万死亡，充分体现了WIV疫苗面临的挑战。当前流感疫苗的有效率仅为10-60%，这主要限于异源免疫有限以及灭活过程导致的免疫原性降低。WIV疫苗接种的缺陷往往指向病毒灭活的化学方法。例如，福尔马林灭活疫苗能够灭活多种病毒的特性——即与氨基酸、RNA和/或DNA发生非特异性交联的反应——也可能导致抗原的破坏、改变或次优呈递给免疫系统。事实上，在早期的临床试验中，基于福尔马林的呼吸道合胞病毒(RSV)WIV疫苗接种因糖蛋白结构受损导致了疾病增强。因此，保持天然糖蛋白结构是WIV疫苗开发的关键。
在过去十年中，几种潜在的广谱抗病毒药物被鉴定出来，它们特异性地作用于病毒膜，通常需要光激活，包括LJ001、JL122和产硫化氢(H2S)的化合物GYY4137。这些化合物对多种囊膜病毒显示抑制特性，包括呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)、尼帕病毒(NiV)等。靶向病毒膜是预防病毒入侵/感染的一个有吸引力的选择；然而，宿主细胞膜的丰度可能会限制此类化合物作为治疗药物的使用。
在这项发表于《Nature Communications》的研究中，康奈尔大学Hector C. Aguilar团队联合多个研究机构，鉴定了一类新型小分子抗病毒化合物(XM系列)，其能靶向病毒膜同时保持病毒表面糖蛋白的完整性，这些特性非常适合疫苗开发。研究人员通过多学科方法深入探究了XM化合物的作用机制，并成功将其应用于流感病毒灭活疫苗的开发，证明了其相较于传统灭活方法的优越性。
研究人员为开展此项研究，主要运用了以下几项关键技术：利用假型病毒（如携带尼帕病毒糖蛋白的VSV病毒）感染模型进行高通量抗病毒活性筛选；通过细胞毒性检测(CCK-8法)评估化合物安全性；采用电子自旋共振(ESR)光谱分析病毒膜脂质有序性和流动性变化；运用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行脂质组学分析，揭示XM-01处理对病毒膜脂质组成的影响；通过流式病毒术(Flow Virometry)和功能性实验（血凝抑制HI、神经氨酸酶抑制NI实验）评估病毒糖蛋白构象和功能的完整性；最后，在小鼠模型中评估了XM-01灭活流感疫苗(XM-01-IIV)的免疫原性和保护效力，包括中和抗体检测、攻毒实验（生存率、体重变化）以及组织病理学和流式细胞术分析免疫细胞应答。
XM化合物抑制囊膜病毒感染
研究团队首先筛选了一个含硫化合物库的抗病毒活性，并与已知的H2S供体（NaHS, GYY4137）以及光依赖性膜融合抑制剂LJ001进行比较。使用基于尼帕病毒(NiV)/水泡性口炎病毒(VSV)的假型病毒(pNiV)报告系统进行测试，发现五个XM化合物（XM-01, -02, -03, -06, -12）在10μM浓度下能显著降低病毒 infectivity。这些活性化合物均含有酰基二硫键，可能 enabling persulfide radical formation。细胞毒性实验表明XM-01在浓度低于300μM时对Vero细胞活力无显著影响。XM-01能广谱抑制多种囊膜病毒（pNiV, HSV-1, RSV, VSV, 流感病毒Ca09株），IC50在1-40μM之间，而对非囊膜病毒轮状病毒无抑制作用。重要的是，XM-01的活性不依赖于光照。
XM-01干扰病毒膜而不影响病毒糖蛋白或RNA
时间进程实验表明，XM-01仅在病毒入侵细胞前阶段起作用，一旦病毒进入细胞，XM-01便无法发挥抑制作用。预先用XM-01处理病毒颗粒（而非宿主细胞）能显著降低感染，表明XM-01直接作用于病毒颗粒。流式病毒术分析显示，XM-01处理并不影响针对NiV F或G糖蛋白的构象抗体的结合，表明糖蛋白天然构象得以保留。对流感病毒的处理也证实，即使在完全灭活病毒的条件下（1 mM XM-01, 4小时），血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的活性也未受显著影响。电镜观察显示，XM-01处理的病毒颗粒出现膜损伤、形态改变和RNA泄漏，这与LJ001的作用类似。体外转录的CHIKV报告RNA实验进一步证明XM-01不影响病毒RNA的功能完整性。
XM-01通过persulfide radical formation改变病毒膜物理性质
为了探究XM-01的作用机制，研究人员进行了深入的生化和生物物理分析。磺酰罗丹明B(SRB)泄漏实验表明XM-01并不破坏病毒膜的完整性。电子自旋共振(ESR)光谱分析揭示，XM-01能够嵌入脂质双分子层深处，特别是疏水核心，增加了膜的有序性和刚性，这可能会降低膜融合能力。这种效应是温度依赖性的，在25°C时比20°C时更明显。XM-01还使POPC和POPC/POPG膜的相变温度提高了约5.3°C和5.8°C，表明膜向更类似凝胶的有序相转变。脂质混合实验证实，XM-01处理能将流感病毒与宿主细胞膜囊泡(PMVs)的融合降低至约5%（对照组为21%）。化学机制研究表明，XM-01与亲核试剂（如丁胺）反应后，检测到了半胱氨酸多硫化物，这是persulfide中间体(RSSH)的分解产物，表明XM-01能够产生perthiyl radicals，这些自由基可能化学修饰病毒膜。加入自由基淬灭剂α-生育酚能部分恢复被XM-01抑制的病毒融合能力，支持了自由基介导的机制。吸收光谱估算表明，经1 mM XM-01处理后，约有0.31 mM的XM-01与病毒膜结合。脂质组学分析显示，XM-01处理导致病毒膜脂质组成发生显著变化，特别是磷脂酰胆碱(PC)与磷脂酰乙醇胺(PE)的比例(PC:PE)从适宜膜融合的范围（0.9-2:1）急剧升高至10.97:1，这主要是由于PE脂质种类的减少。此外，还观察到脂质不饱和度的全局性增加以及溶血脂质的增加，这些变化使得膜融合过程中所需的负膜曲率形成在能量上更为不利。
接种XM-01灭活病毒可改善中和抗体反应并对活病毒攻击产生保护
作为原理验证，研究人员利用XM-01的特性开发了一种改进的流感灭活疫苗(IIV)。他们优化了用XM-01、JL-122和0.02%多聚甲醛(PFA)完全灭活流感病毒的条件。用1 mM XM-01、0.02% PFA或10μM JL122处理病毒4小时可完全灭活流感病毒，而不影响HA或NA功能。小鼠实验显示，肌肉注射1 mM XM-01对小鼠体重无影响。研究人员将小鼠分为五组，分别肌肉接种XM-01-IIV、JL-122-IIV、PFA-IIV、活流感病毒或PBS（模拟对照），所有疫苗均与佐剂明矾1:1混合。小鼠接受两次疫苗接种（间隔2周），在第二次接种后7-10天收集血清评估中和抗体(NAbs)。令人印象深刻的是，XM-01-IIV疫苗接种的小鼠产生了显著高于PFA-IIV或JL-122-IIV组的抗HA和抗NA中和抗体滴度，其水平几乎与活病毒疫苗接种组相当甚至更优（尤其在雌性小鼠中）。值得注意的是，XM-01-IIV诱导的抗NA NAb反应显著增强，而传统IIV疫苗通常难以诱导强烈的抗NA NAb反应。空斑减少中和试验(PRNT)证实，所有疫苗组血清均能中和同源病毒株(A/California/04/2009)，但只有XM-01-IIV和JL-122-IIV组血清对异源病毒株(A/WSN/1933)显示出可测量的中和活性。抗体亚型分析显示，活病毒和XM-01疫苗接种是唯一能显著诱导更多IgM抗体的方式。攻毒实验表明，接种XM-01-IIV或活病毒疫苗的小鼠全部存活，而PFA-IIV组存活率为80%，模拟对照组全部在感染后6天内死亡。在体重减轻（疾病严重程度指标）方面，XM-01-IIV组小鼠的发病率显著低于PFA-IIV组，与活病毒对照组相当。组织学分析和流式细胞术检测进一步支持了XM-01衍生疫苗能诱导更强的免疫保护。接种后第5天，PBS和JL-122-IIV组小鼠肺部出现更严重的支气管周围和血管周围炎症，伴有气道内变性中性粒细胞和细胞碎片；而PFA-IIV、XM-01-IIV和活病毒组炎症较轻，无气道内变性中性粒细胞迹象。流式细胞分析显示，活病毒、XM-01-IIV和PFA-IIV疫苗接种组小鼠肺部中性粒细胞和CD8+T细胞浸润减少，纵隔淋巴结中生发中心B细胞比例增加，表明疫苗接种产生了积极的特异性免疫应答。
本研究报道了一类具有广谱抑制特性的抗病毒化合物，并证明了其作为病毒灭活剂用于流感疫苗开发的潜力。XM-01通过物理和化学方式改变病毒膜脂质双分子层，增加膜有序性和刚性，提高相变温度，从而抑制膜融合，同时不显著影响病毒糖蛋白或RNA完整性。利用XM-01的这些独特性质，研究人员成功开发了一种概念验证性的全病毒灭活流感疫苗。在小鼠流感模型中，XM-01灭活疫苗相较于传统PFA灭活疫苗，能诱导更强效的针对HA和NA的中和抗体反应，攻毒后显著降低发病率和死亡率，保护效果与活病毒疫苗相当。该研究不仅揭示了一类新型抗病毒化合物的作用机制，更重要的是为改进囊膜病毒灭活疫苗提供了一种创新策略。通过靶向病毒膜而非病毒蛋白进行灭活，XM化合物能够更好地保留病毒表面抗原的天然构象，从而可能诱导更优质、更广泛的免疫保护。未来，通过优化persulfide radical形成速率等化学特性，有望开发出活性更优的衍生物，进一步提升疫苗开发效果。评估XM-01对其他囊膜病毒的灭活效果将是重要的未来研究方向。这项原理验证性研究为改善灭活流感疫苗乃至其他囊膜病毒疫苗的开发提供了新的思路和工具，在应对新发和再现病毒威胁方面具有潜在的重要应用价值。
