《Virulence》：Streptococcus mutans-derived extracellular vesicles promote herpes simplex virus infection in oral epithelia
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本文揭示了口腔主要致病菌变形链球菌（S. mutans）来源的胞外囊泡（Sm EVs）通过激活表皮生长因子受体（EGFR）-细胞外信号调节激酶（ERK）通路，显著抑制I型（IFN-α/β）、II型（IFN-γ）和III型（IFN-λ1/λ2/λ3）干扰素的表达，从而削弱宿主先天抗病毒免疫，最终增强单纯疱疹病毒1型（HSV-1）在人口腔角质形成细胞（HOK）和口腔黏膜类器官中的复制。该研究为理解口腔菌群-病毒互作提供了新视角。
ABSTRACT
口腔是人体第二大微生物群落栖息地，细菌与病毒在此共存。变形链球菌（Streptococcus mutans）是口腔中的一种主要致病菌，通常与龋齿相关。本研究探讨了S. mutans来源的胞外囊泡（Sm EVs）对口腔中普遍存在的单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染的影响。实验在人口腔角质形成细胞（HOK）和黏膜组织来源的类器官中进行，并通过qPCR分析了50例人全唾液样本中S. mutans与HSV-1包膜糖蛋白D（gD）mRNA水平的相关性。结果显示，Sm EVs能显著增强HSV-1在黏膜类器官中的产量。在模拟感染条件下，与溶剂对照组相比，经Sm EVs处理的黏膜类器官中I型（IFN-α和IFN-β）、II型（IFN-γ）和III型（IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3）干扰素的mRNA和/或蛋白水平均显著降低。当在Sm EV预处理后引入HSV-1时，这些干扰素水平与溶剂对照组相比也呈现统计学上显著降低的总体趋势。机制研究表明，Sm EVs通过上调黏膜细胞中的EGFR – ERK通路来抑制干扰素mRNA和蛋白水平，从而创造一个有利于HSV-1增殖的环境。有趣的是，在人全唾液样本中检测到S. mutans与HSV-1之间存在正相关关系。这些结果表明，S. mutans可通过分泌EVs负向调控宿主先天抗病毒反应，从而增强病毒产量。本研究可能为控制人类病毒感染提供新的视角。
Introduction
Streptococcus mutans是一种革兰氏阳性菌，常引起龋齿和牙周病，其形成生物膜的能力是其主要毒力因子。细菌胞外囊泡（EVs）在宿主-微生物相互作用中扮演关键角色，其分子复杂性可与亲代细菌膜相媲美。这些纳米级（20–400 nm）脂质双层囊泡含有RNA、DNA、蛋白质、脂质和代谢物等多种 cargo，通过与宿主细胞相互作用发挥多种生物学效应。细菌EVs可通过内吞作用、脂筏介导的运输和膜融合等方式输出至其他细胞，对于双分子货物的细胞间运输至关重要。此外，细菌EVs参与毒力、致病性、细胞间通讯、生物膜形成和抗生素耐药性。革兰氏阳性菌来源的EVs因含有毒素、免疫逃逸蛋白和粘附素而具有毒力。最近研究表明，S. mutans来源的EVs（Sm EVs）能产生与亲代细菌相似的生物膜，表明细菌EVs可能携带其毒力因子。此外，细菌EVs与人类疾病包括癌症和炎症性疾病有关，但其在调节病毒感染中的作用尚未被充分探索。
单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是一种双链DNA病毒，属于疱疹病毒科，主要感染脊椎动物。HSV-1结构包括衣壳、皮层、糖蛋白和脂质双层包膜，病毒入侵由糖蛋白介导，特别是gD，其与细胞受体如疱疹病毒入侵介质（HVEM）和nectin-1结合。HSV-1感染通常始于口面部途径，病毒进入口腔黏膜上皮。在免疫正常个体中，HSV-1感染通常较轻，但在免疫低下情况下，病毒再激活可能导致中枢神经系统受累。
新证据表明，宿主免疫系统可受细菌及其EVs的影响。由于病毒感染严重程度显著依赖于宿主免疫状态，口腔微生物群与病毒感染结果之间可能存在密切关系。事实上，与某些细菌的共感染已被证明可增强或抑制病毒复制。例如，Streptococcus sanguinis或 Fusobacterium nucleatum降低了HSV-1病毒产量，而Aggregatibacter actinomycetemcomitans改变了细胞因子反应并增加了HSV-1 DNA水平。Porphyromonas gingivalis和 F. nucleatum可激活潜伏的Epstein-Barr病毒（EBV）。此外，P. gingivalis可通过产生丁酸修饰宿主染色质来再激活潜伏的EBV。这些发现提出了微生物组分（包括EVs）可能影响病毒致病性的可能性。鉴于Streptococcus mutans是口腔的优势定植菌，我们评估了Streptococcus mutansEVs对口腔上皮细胞和类器官中HSV-1感染的影响，重点关注其免疫调节功能。
Materials and methods
Reagents
实验使用了多种抗体和抑制剂，包括抗EGFR、磷酸化EGFR（Tyr 1173）、ERK1/2、磷酸化ERK（Tyr204）、KRT13、HSV-1 gD、β-actin等抗体，以及EGFR抑制剂AG1478和ERK抑制剂PD98059。
Cell line and human oral mucosa-derived organoids
使用了猴肾Vero细胞和人口腔角质形成细胞（HOK）系。从口腔鳞状细胞癌（OSCC）切除术中获得的人口腔黏膜组织样本用于培养类器官和原代上皮细胞。类器官培养方法参照已有文献。
Bacterial culture and EV isolation
S. mutans菌株在脑心浸液培养基中培养，通过超速离心法分离EVs。使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）对EVs的浓度和形态进行表征。
HSV-1 propagation and quantification
HSV-1病毒在Vero细胞中繁殖，通过噬斑测定法进行病毒滴度滴定。
Cell viability following Sm EV pretreatment and HSV-1 infection
通过MTT法检测Sm EVs预处理及HSV-1感染对细胞活力的影响。
Direct co-culture of S. mutanswith HOK cells
将活菌或热灭活S. mutans与HOK细胞直接共培养，之后感染HSV-1，检测gD mRNA水平。
HSV-1 infection in HOK cells and organoids
细胞或类器官经Sm EVs预处理后感染HSV-1，收集上清液检测病毒gD mRNA和蛋白水平。
Western blot analysis
使用蛋白质印迹法分析相关蛋白表达。
Rt-qPCR
通过实时定量PCR检测基因表达水平，包括干扰素基因和病毒gD基因。
Live/Dead and IF staining
使用钙黄绿素AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI）进行活/死细胞染色，并通过免疫荧光（IF）染色检测特定蛋白。
ELISA
通过酶联免疫吸附测定法检测干扰素蛋白浓度。
Ethical approval and consent to participate
本研究使用的人体组织标本和唾液样本均获得患者知情同意，并经过相关机构伦理委员会批准。
Statistical analysis
使用GraphPad Prism软件进行统计分析，组间差异采用非配对t检验，相关性采用Pearson相关分析。
Results
Sm EVs enhanced HSV-1 infection in HOK cells
通过TEM和NTA确认分离的Sm EVs呈球形，大小在50-200 nm之间。共聚焦显微镜观察证实Nile Red标记的Sm EVs可被HOK细胞内化。细胞活力实验表明，在测试浓度范围内（10-103particles/cell），Sm EVs对HOK细胞无显著毒性。选择103particles/cell的Sm EVs进行后续实验。噬斑实验和qPCR分析显示，Sm EVs预处理显著增强了HSV-1在HOK细胞中的复制，表现为病毒gD mRNA水平升高和病毒滴度（PFU）增加。与热灭活细菌相比，活S. mutans直接共培养也能产生类似的增强HSV-1感染的效果。
Sm EVs enhanced HSV production in human organoids cultured from oral mucosal tissues
成功培养了来自舌和下颌组织的人口腔黏膜类器官，并通过KRT13免疫荧光染色确认其上皮特性。选择MOI 0.1进行HSV-1感染实验，因为更高MOI（0.5）会导致类器官结构严重破坏。在模拟感染条件下，Sm EVs处理本身未引起类器官明显的形态变化或活力下降。然而，在HSV-1感染条件下，Sm EVs预处理显著加剧了类器官的上皮破坏，增加了病毒gD蛋白和mRNA水平，并导致更高的病毒滴度和细胞死亡。
Sm EVs downregulated cytokine expression in HSV-1-infected oral mucosal organoids
为探究Sm EVs增强HSV-1感染的机制，检测了I型（IFN-α, IFN-β）、II型（IFN-γ）和III型（IFN-λ1, λ2, λ3）干扰素的表达。qPCR和ELISA结果显示，在模拟感染和HSV-1感染条件下，Sm EVs预处理均能显著降低类器官中这些干扰素的mRNA和蛋白水平。使用Poly(I:C)作为阳性对照，确认实验系统能够检测到干扰素的诱导表达。
EGFR – ERK plays a role in the Sm EV-mediated enhancement of HSV-1 infection
机制探索发现，Sm EVs处理可导致EGFR和ERK的磷酸化水平升高。使用EGFR抑制剂AG1478或MEK抑制剂PD98059预处理，能够逆转Sm EVs引起的HSV-1 gD蛋白表达上调，并恢复干扰素的表达水平。蛋白质印迹分析进一步证实，Sm EVs诱导的NF-κB磷酸化也可被AG1478抑制。噬斑实验表明，EGFR或ERK信号通路抑制可显著降低Sm EVs增强的HSV-1病毒产量。在原代口腔上皮细胞中也观察到了类似的趋势。
Correlation between qPCR-detected S. mutansand HSV-1 mRNA levels in human saliva
对50名健康个体的全唾液样本进行分析，发现S. mutans16S rRNA与HSV-1 gD mRNA水平之间存在显著的正相关关系（R= 0.3487, p= 0.0131），这一趋势在男性和有饮酒史的个体中更为明显。这为S. mutans可能通过EVs介导的机制调节宿主对HSV-1的易感性提供了临床相关性支持。
Discussion
本研究首次揭示了S. mutans来源的EVs可通过激活EGFR-ERK信号通路，抑制宿主I型、II型和III型干扰素反应，从而增强HSV-1在口腔上皮细胞和类器官中的感染。研究发现Sm EVs的免疫调节作用具有时间依赖性，早期可能诱发短暂的干扰素反应，但后期表现为持续的抑制。与亲代活菌共培养实验结果的相似性，表明EVs介导的效应具有生物学相关性。临床唾液样本中S. mutans与HSV-1载量的正相关，进一步提示了这种菌群-病毒互作在人体内的潜在意义。与其他口腔链球菌（如S. sobrinus和 S. mitis）EVs的比较，表明这种免疫调节活性可能具有菌株特异性。未来研究需要明确Sm EVs中负责触发宿主信号通路的具体分子成分（如核酸、脂磷壁酸等），并开展纵向研究以阐明体内微生物-病毒相互作用的因果及时序关系。本研究为理解口腔微环境中细菌-病毒互作提供了新见解，并为开发针对口腔微生物组的病毒感染预防策略奠定了基础。
