《TRENDS IN Biotechnology》：CRISPR/Cas strategies to enhance CAR T-cell function and persistence via metabolic reprogramming
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这篇发表于《生物技术趋势》的综述聚焦于利用CRISPR/Cas基因编辑技术改造CAR T细胞代谢，以解决其功能耗竭和持久性不足的核心挑战。文章系统梳理了通过靶向糖酵解、线粒体生物合成、代谢物调控等关键通路，促进氧化磷酸化（OXPHOS）和记忆样表型形成的策略，并探讨了超越传统免疫检查点、靶向转录、表观遗传和细胞因子等新型调控靶点，为下一代CAR-T疗法的开发提供了前沿视角。
当前CAR T细胞疗法的成功与挑战
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已成为多种血液癌症的标准治疗方法，但其在更广泛疾病中的应用潜力尚未完全发挥。一个关键的制约因素是T细胞随时间推移逐渐耗竭和分化，导致CAR阳性细胞丢失。CRISPR/Cas基因操纵技术近年来彻底改变了该领域。本综述将审视旨在改善CAR T细胞功能和持久性以对抗耗竭和功能障碍问题的CRISPR/Cas应用，重点关注代谢重编程。
免疫检查点阻断通过代谢调节缓解CAR T细胞耗竭
T细胞耗竭是持续抗原暴露和细胞活化过程中功能进行性障碍的标志，严重削弱了治疗效果。最初缓解CAR T细胞耗竭的努力是使用免疫检查点阻断（CPB），但临床联合试验结果参差不齐。CRISPR/Cas编辑作为一种替代方法出现，可在CAR T细胞内源性破坏免疫检查点，使其对检查点介导的抑制产生固有抵抗，同时最小化脱靶效应。最新研究发现，免疫检查点信号与T细胞代谢密切相关。例如，PD-1和CTLA-4抑制效应T细胞的糖酵解和线粒体功能，而CPB通过恢复线粒体生物合成和代谢灵活性来逆转这些效应。
操纵CAR T细胞代谢以延长干性及功能
近期研究强调了T细胞代谢在增强CAR T细胞疗法中的关键作用。代谢与T细胞命运内在关联：初始T细胞主要依赖氧化磷酸化（OXPHOS）供能，而活化后的T细胞转向糖酵解以满足即时能量需求，但这限制了记忆形成。因此，大多数旨在改善CAR T细胞功能的代谢操纵研究侧重于在效应细胞中重建OXPHOS依赖，以促进干性和记忆形成。
影响T细胞代谢的通路
抗原刺激后，T细胞启动多种细胞内信号级联反应。经典的PI3K/Akt/mTOR信号通路对于将细胞代谢重编程至糖酵解至关重要。因此，靶向该通路已成为增强T细胞干性和功能的策略。例如，Akt抑制可促进干性和脂肪酸氧化。其他策略包括直接抑制糖酵解以促进OXPHOS，例如使用基于CRISPR/Cas13d的平台同时敲低HK1、HK2、Akt1和Akt2，从而抑制有氧糖酵解，增强OXPHOS，并减少耗竭。改善线粒体功能是另一有前景的途径。记忆CD8+T细胞依赖强大的线粒体质量和生物发生来支持长期存活。过表达PGC-1α可增强OXPHOS活性、增殖和记忆形成。
代谢物
改变关键代谢物（如葡萄糖、脂质、氨基酸）的水平塑造了T细胞的活化、分化和功能。在肿瘤微环境（TME）中，耗竭的T细胞释放腺苷（Ado）抑制免疫。其代谢产物肌苷（Ino）则促进CAR T细胞下调糖酵解、上调OXPHOS，表现出更强的干性。牛磺酸和乳酸等代谢物也在调节T细胞功能中扮演重要角色。例如，乳酸脱氢酶B（LDHB）的过表达可上调T细胞OXPHOS，抵消乳酸对T细胞功能的抑制作用。
其他靶向免疫和表观遗传调节因子的CRISPR/Cas策略
除了代谢重编程，许多新的免疫和表观遗传靶点正在通过CRISPR/Cas应用被发现。例如，CRISPR/Cas9敲除蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN2可增强T细胞增殖、细胞毒性和抗肿瘤反应。转录抑制因子Blimp-1的敲除可增强记忆形成、束。表观遗传调节因子TET2或DNMT3A的破坏也能改善CAR T细胞功能，但需注意失控增殖的风险。细胞因子信号也是关键调节因子，例如敲除TGFβ受体II（TGFBRII）可使CAR T细胞抵抗TGFβ的免疫抑制。
结论与未来展望
尽管面临脱靶效应、递送系统效率和安全性的挑战，CRISPR/Cas技术正在变革CAR T细胞工程。基于当前临床前结果，靶向基因调控，特别是代谢重编程，有潜力通过增强CAR T细胞的功能和持久性，将其应用范围扩展到更广泛的疾病领域。未来需要整合瞬时、可调控的CRISPR方法（如CRISPRa/i），并开发先进的递送系统，以推动这些策略向安全有效的临床疗法转化。
